In vitro celcultuurmodel voor Toxic Geïnhaleerd chemische testen
Summary
Dit protocol is ontworpen om blootstelling werkwijze celculturen aan geïnhaleerd giftige chemicaliën tonen. Blootstelling van gedifferentieerde lucht-vloeistof interface (ALI) culturen van epitheelcellen biedt een uniek model van de luchtwegen blootstelling aan giftige gassen zoals chloor. In dit manuscript beschrijven we effect van chloor blootstelling aan lucht-water grensvlak kweken van epitheelcellen en ondergedompelde kweek van cardiomyocyten. In vitro blootstelling systemen kunnen belangrijke mechanistische studies routes die vervolgens kunnen worden gebruikt om nieuwe therapeutische middelen te ontwikkelen evalueren.
Abstract
Celculturen onmisbaar te ontwikkelen en bestuderen werkzaamheid van therapeutische middelen vóór het gebruik in diermodellen. Wij hebben de unieke mogelijkheid om het model goed gedifferentieerd menselijke luchtwegepitheel en hartspiercellen. Dit kan een waardevol instrument om de schadelijke effecten van toxische geïnhaleerde stoffen, zoals chloor, die normaal kan zijn op het celoppervlak, en vormt diverse bijproducten na reactie met water, en het beperken van hun effecten ondergedompelde culturen bestuderen. Ons model met behulp van goed gedifferentieerd menselijke luchtwegen epitheelcelkweken bij lucht-liqiuid-interface omzeilt deze beperking evenals biedt een gelegenheid om kritische mechanismen van toxiciteit van potentieel giftige ingeademde stoffen te evalueren. We beschrijven verbeterde verlies van membraan integriteit, caspase vrijlating en dood aan giftige chemische ingeademde zoals blootstelling chloor. In dit artikel hebben we methodes voorgesteld om de blootstelling chloor modelleren in zoogdiercellen hart en luchtweg epitheel cellen in cultuur en eenvoudige tests om het effect op deze celtypen te evalueren.
Introduction
Blootstelling aan giftige geïnhaleerde stoffen (TIC) / gassen zoals chloor (Cl 2) blijft een voortdurende gezondheidsprobleem in toevallige blootstelling en hun mogelijk gebruik als een chemisch agens bedreiging. Hoewel de longen zijn de primaire doelwit zijn organen zoals hart en de hersenen ook beïnvloed 1-3. In vivo modellen worden algemeen gebruikt voor de toxiciteit van tics, maar in vitro assays voor toxiciteitsbeoordeling eenvoudiger, sneller en goedkoper. In vitro modellen laten ook uitgebreid onderzoek van middel-cel interacties die moeilijk te evalueren in vivo kunnen zijn. Dergelijke in vitro belichtingssystemen zijn zeldzaam en bovendien in sommige conventionele modellen waarin giftige stoffen worden toegevoegd aan het kweekmedium waarin de cellen ondergedompeld zijn, de eigenschappen van de agenten kunnen veranderen als gevolg van interacties en binding aan componenten in het medium. In dergelijke scenario's celkweek systemen zoals lucht-vloeistof interface (ALI) Culturen van primaire humane epitheelcellen, hier voorgesteld, die direct kunnen worden blootgesteld aan gasvormige middelen kunnen zijn veelbelovend.
Epitheelcellen van de luchtwegen zijn de eerste regels van de verdediging tegen ingeademde giftige chemicaliën. De menselijke luchtwegepitheel vormt een fysieke barrière tussen het lumen en de onderliggende cellen in de long en deelneemt aan de reactie van de long. Het produceert een aantal cytokines en andere pro-en anti-inflammatoire middelen en scheidt slijm / luchtwegen oppervlak vloeibaar (ASL) die het epitheel. Een van de beperkingen in conventionele ondergedompeld in vitro kweeksystemen is ook dat de ASL en slijm dat de epitheliale oppervlak bedekken wordt verwijderd of verdund. Dit strookt niet met de fysiologische toestand van longepitheelcellen die zijn blootgesteld aan de lucht. Daarom zou een ideaal in vitro systeem voor TIC toxiciteit deze architectuur repliceren. Er is grote belangstelling voor de ontwikkeling snelle screening methoden dat in vivo toxiciteit voorspellen. Epitheliale cellen gekweekt bij de ALI differentiëren en hebben goed gedifferentieerde structuren en functies in vergelijking met cellen gekweekt onder water en een superieur model van de luchtwegen dienen.
In deze studie beschrijven we het gebruik van lucht-vloeistof-interface van de cultuur van de menselijke luchtwegen (tracheobronchiale) epitheelcellen voor het testen van giftige inhalatie toxiciteit gas en vergelijk het met een verzonken celkweek van cardiomyocyte, vandaar studie van een ander belangrijk doelwit voor de toxiciteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest voorkomende vorm van acute blootstelling aan gifstoffen ontstaat wanneer men ademt een giftige chemische stof in de longen. Deze chemicaliën kunnen ook snel worden opgenomen in de bloedbaan en invloed kan andere organen zoals hersenen en het hart. Giftigheid bij inademen van diverse agenten met behulp van diermodellen worden bestudeerd en op grote schaal gemeld, maar de mechanismen zijn minder goed begrepen. Dit is een belangrijke hindernis in de ontwikkeling van effectieve therapieën. Afwezigheid van in …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek wordt ondersteund door het tegengaan Program, National Institutes of Health (NIH), Bureau van de directeur, en de National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Grant Number U54 ES015678 (CWW). SA wordt ook ondersteund door Kinderziekenhuis Colorado / Colorado School of Mines Samenwerking Pilot Award # G0100394 en Children's Hospital Colorado Research Institue Pilot Award # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referenzen
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
