בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות
Summary
פרוטוקול זה נועד להדגים שיטת חשיפה של תרביות תאים לכימיקלים רעילים בשאיפה. חשיפה של ממשק אוויר נוזלי מובחן תרבויות (עלי) של תאי אפיתל דרכי הנשימה מספקת מודל ייחודי של חשיפת דרכי הנשימה לגזים רעילים כגון כלור. בכתב יד זה אנו מתארים השפעה של חשיפת כלור בתרבויות ממשק אוויר הנוזלי של תאי האפיתל ותרבות שקועה של שריר לב. במבחנה מערכות חשיפה לאפשר מחקרים מכניסטית חשובים להעריך מסלולים כי אז יכול להיות מנוצל כדי לפתח סוכנים טיפוליים חדשניים.
Abstract
תרביות תאים הן הכרחיות כדי לפתח ולחקור את היעילות של סוכנים טיפוליים, לפני השימוש בם במודלים של בעלי חיים. יש לנו את היכולת הייחודית למודל תאי אפיתל דרכי הנשימה האנושית ושריר לב מובחנים היטב. זה יכול להיות כלי רב ערך כדי לחקור את ההשפעות המזיקות של כימיקלים רעילים בשאיפה, כגון כלור, שיכולים בדרך כלל אינטראקציה עם משטחי התאים, ויוצרים תוצרי לוואי שונים על מגיב עם מים, ולהגביל את ההשפעות שלהם בתרבויות מתחת למים. המודל שלנו באמצעות תרביות תאי אפיתל דרכי הנשימה אנושית מובחנות היטב בממשק אוויר liqiuid עוקף מגבלה זו, כמו גם מספק הזדמנות להעריך מנגנונים קריטיים של רעילות של כימיקלים בשאיפה רעילים פוטנציאליים. אנו מתארים אובדן משופר של שלמות קרום, שחרור caspase ומוות על כימי בשאיפה רעילה כגון חשיפת כלור. במאמר זה, אנו מציעים שיטות למודל חשיפת כלור בלב של יונקים ודרכי הנשימה אפיתל גאמות בתרבות ובבדיקות פשוטות כדי להעריך את השפעתה על אלו סוגי תאים.
Introduction
חשיפה לכימיקלים בשאיפה רעילה (טיקים) / גזים כגון כלור (Cl 2) נשארה דאגה לבריאות מתמשכת בחשיפה מקרית, כמו גם בשימוש בם פוטנציאל כסוכן איום כימי. למרות הריאות הן היעד העיקרי, איברים כמו לב ומוח מושפעים גם 1-3. בvivo מודלים משמשים בדרך כלל לבדיקת רעילות מטיקים, אבל במבחני חוץ גופית להערכת רעילות הם פשוט יותר, מהיר יותר וחסכוניים יותר. ב מבחנה מודלים גם לאפשר חקירה מקיפה של אינטראקציות סוכן תאים שעלולות להיות קשה להעריך in vivo. במבחנה מערכות חשיפה כזו הן נדירות ויותר מכך, בחלק מהדגמים קונבנציונליים שבו חומרים רעילים נוספים למדיום התרבות שבו תאים שקועים, את המאפיינים של הסוכנים יכולים להשתנות עקב אינטראקציות ומחייבים את רכיבים במדיום. במערכות כאלה תרחישי תא תרבות כגון ממשק אוויר נוזלי (ALIתרבויות) של תאים ראשוניים נשימה אנושית אפיתל, שהוצעו כאן, שיכול להיות חשוף ישירות לסוכנים של גזים יכולים להיות מבטיחות.
תאי האפיתל המצפים את דרכי הנשימה הם קווי ההגנה הראשונים נגד כימיקלים רעילים בשאיפה. אפיתל דרכי הנשימה האנושית מהווה מכשול פיזי בין לומן והתאים שבבסיס בריאה ומשתתף בתגובה של הריאות. היא מייצרת מספר ציטוקינים וסוכנים פרו ואנטי דלקתיים אחרים, כמו גם מפריש נוזל ריר פני השטח / בדרכי הנשימה (הגובה מעל פני הים) המכסה את האפיתל. אחת המגבלות בקונבנציונליות שקוע במערכות תרבות חוץ גופית הוא גם שהגובה מעל פני הים והריר שמכסים את פני השטח האפיתל מוסר או מדולל. זה אינו משקף את המצב הפיזיולוגי של תאי אפיתל ריאה שנחשפים לאוויר. לכן, אידיאלי במערכת מבחנה לבדיקת רעילות TIC צריך לשכפל ארכיטקטורה זו. יש עניין רב בפיתוח מ 'סינון מהירethods כי לחזות ברעילות vivo. תאי האפיתל גדלו בALI להבדיל ויש מבנים ופונקציות מובחנים היטב בהשוואה לתאים שגודל מתחת למים ולשמש מודל מעולה של דרכי הנשימה.
במחקר זה, אנו מתארים את השימוש של תרבות האוויר נוזלי ממשק של נשימה אנושית תאים (tracheobronchial) אפיתל לבדיקת רעילות גז בשאיפה רעילה ולהשוות אותו עם תרבית תאים שקועה של cardiomyocyte, ומכאן לומדים עוד יעד חשוב של רעילות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הסוג הנפוץ ביותר של חשיפות רעילות אקוטיות מתרחש כאשר אחד נושם כימי רעילה לריאות. כימיקלים אלו יכולים גם להיות שנלקחו במהירות במחזור הדם ועלולים להשפיע על איברים אחרים כגון מוח ולב. רעילות שאיפה של סוכנים שונים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים נלמדות ודווחה בהרחבה, לעו?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי התכנית לנטרל, המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), משרדו של המנהל, והמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) גרנט מספר U54 ES015678 (CWW). SA נתמך גם על ידי בית החולים לילדים בית הספר למכרות שיתוף הפעולה G0100394 # טייס פרס ו# G0100471 החולים קולורדו "מכון מחקר פיילוט פרס לילדים קולורדו / קולורדו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referenzen
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
