В пробирке клеточных культур модели для токсичных ингаляционной химической тестирования
Summary
Этот протокол предназначен для демонстрации метода экспозиции клеточных культур в ингаляционных токсичных химических веществ. Выдержка из дифференцированной воздуха и жидкой фаз (ALI) культур эпителиальных клеток дыхательных путей предоставляет уникальную модель воздействия дыхательных путей токсичных газов, таких как хлор. В этой рукописи мы опишем эффект воздействия хлора на воздух-жидкость культур эпителиальных клеток и глубинной культуре кардиомиоцитов. В пробирке системы воздействия позволяют важные механистические исследования для оценки пути, которые могли бы быть использованы для разработки новых терапевтических агентов.
Abstract
Клеточные культуры необходимы для развития и изучения эффективности терапевтических агентов, до их использования в животных моделях. У нас есть уникальная возможность моделировать хорошо дифференцированных человеческих эпителия дыхательных путей и клетки мышцы сердца. Это может быть бесценным инструментом для изучения вредных эффектов токсичных ингаляционных химических веществ, таких как хлор, которые могут нормально взаимодействовать с поверхности клеток, и образуют различные побочные продукты при взаимодействии с водой, а также ограничение их последствий в затопленных культур. Наша модель, используя хорошо дифференцированных культур человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток на радиоинтерфейса-liqiuid обходит это ограничение, а также предоставляет возможность оценить критические механизмы токсичности потенциальных ядовитых ингаляционных химических веществ. Мы описываем повышенную потерю целостности мембраны, каспазы-релиз и смерть токсичных вдыхаемого химических например воздействия хлора. В этой статье мы предлагаем методы для моделирования воздействия хлора в сердце млекопитающих и дыхательных путей эпителиальных слоктей в культуре и простых тестов, чтобы оценить его влияние на этих типов клеток.
Introduction
Воздействие токсичных химических веществ, вдыхаемых (тики) / газы, такие как хлор (Cl 2) остается постоянной проблемой здравоохранения в случайных воздействий, а также в их потенциальное использование в качестве химического агента угрозы. Хотя легкие являются первичной мишенью, органы, такие как сердце и мозг, также страдают 1-3. IN VIVO модели, как правило, используется для тестирования токсичности от ТЭП, но в пробирке тесты для оценки токсичности проще, быстрее и более экономически эффективным. В модели пробирке также предусмотреть возможность широкого исследования агент-клеточных взаимодействий, которые могут быть трудно оценить в естественных условиях. Такие пробирке системы, связанный с воздействием редки и, более того, в некоторых обычных моделей, где токсичные вещества добавляются к культуральной среде, в которой клетки погруженной, свойства агентов могут изменяться в связи с взаимодействиями и связывание с компонентами в среде. В таких случаях клеточных систем культуры, таких как воздух-жидкость (ALI) культур первичных человеческих эпителиальных клеток дыхательных путей, предлагаемых здесь, которые могут быть непосредственно подвергающихся газообразных агентов может быть перспективным.
Эпителиальные клетки, выстилающие дыхательные пути являются первыми линии обороны против ингаляционных токсичных химических веществ. Человеческий эпителий дыхательных путей образует физический барьер между просветом и нижележащих клеток в легких и участвует в реакции легких. Она производит ряд цитокинов и других про-и противовоспалительных средств, а также выделяет поверхностную слизь / дыхательных путей жидкостью (ASL), покрывающую эпителий. Одним из ограничений в обычных погружен в культурах клеток также, что ASL и слизи, которые покрывают поверхности эпителиальных удалена или разбавленный. Это не отражает физиологическое состояние легких эпителиальных клеток, которые подвергаются воздействию воздуха. Таким образом, идеал в системе экстракорпорального для испытаний на токсичность TIC должны повторить эту архитектуру. Существует большой интерес к разработке быстрого скрининга мethods которые предсказывают в естественных условиях токсичности. Эпителиальные клетки, выращенные на ALI дифференцировать и имеют хорошо дифференцированные структуры и функции по сравнению с клетками, выращенных затопленных и служить превосходной модель дыхательных путей.
В этом исследовании, мы описываем использование воздушно-жидкостным интерфейса культуры человеческого дыхательных путей (трахеобронхиального) эпителиальных клеток для тестирования ядовитый вдыхаемый газ токсичность и сравнить его с глубинной культуре клеток кардиомиоцитов, следовательно, изучая еще один важный цель токсичности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее распространенным типом острых токсичных веществ происходит, когда один дышит ядовитый химикат в легкие. Эти химические вещества могут также быстро переносят в кровоток и может повлиять на другие органы, такие как мозг и сердце. Ингаляционная токсичность различных агентов, ис…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование проводится при поддержке Программы противодействия, Национального института здоровья (NIH), Канцелярии Директора и Национального института гигиены окружающей среды наук (NIEHS) номер гранта U54 ES015678 (CWW). SA также поддерживается Детской больнице Колорадо / Colorado School шахт Сотрудничество Пилот премии # G0100394 и Детская больница Колорадо Исследования Institue Пилот премии # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referenzen
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
