Cellulaire in vitro modèle de culture pour le contrôle des produits chimiques toxiques inhalés
Summary
Ce protocole est conçu pour démontrer Procédé d'exposition de cultures cellulaires à des produits chimiques toxiques inhalés. Exposition des différenciée interface air-liquide (ALI) des cultures de cellules épithéliales des voies aériennes fournit un modèle unique de l'exposition des voies respiratoires à des gaz toxiques tels que le chlore. Dans ce manuscrit, nous décrivons effet de l'exposition au chlore sur les cultures à l'interface air-liquide de cellules épithéliales et de la culture submergée de cardiomyocytes. In vitro des systèmes d'exposition permettent études mécanistiques importantes pour évaluer les voies qui pourraient ensuite être utilisés pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.
Abstract
Les cultures cellulaires sont indispensables pour développer et d'étudier l'efficacité d'agents thérapeutiques, en vue de leur utilisation dans des modèles animaux. Nous avons la capacité unique de modéliser les cellules de l'épithélium respiratoire humain et le muscle cardiaque bien différenciées. Cela pourrait être un outil précieux pour étudier les effets délétères des produits chimiques toxiques inhalés, tels que le chlore, qui peuvent normalement interagir avec les surfaces cellulaires, et former divers sous-produits lors de la réaction avec de l'eau, et la limitation de leurs effets dans des cultures submergées. Notre modèle en utilisant des cultures de cellules épithéliales des voies aériennes humaines bien différenciés à l'interface air-liqiuid contourne cette limitation ainsi que fournit l'occasion d'évaluer les mécanismes critiques de la toxicité des produits chimiques toxiques inhalés potentiels. Nous décrivons perte accrue de l'intégrité de la membrane, la caspase libération et la mort sur chimique toxique par inhalation tels que l'exposition au chlore. Dans cet article, nous proposons des méthodes pour modéliser l'exposition au chlore dans le cœur des mammifères et des voies respiratoires épithéliales caunes de la culture et des tests simples pour évaluer son effet sur ces types cellulaires.
Introduction
L'exposition à des produits chimiques toxiques inhalés (CIT) / gaz comme le chlore (Cl 2) demeure un problème de santé en cours dans les expositions accidentelles ainsi que dans leur utilisation potentielle comme un agent de menace chimique. Bien que les poumons sont la cible principale, les organes tels que le coeur et le cerveau sont également touchés 1-3. Modèles in vivo sont généralement utilisés pour les tests de toxicité de TIC, mais des essais in vitro pour l'évaluation de la toxicité est plus simple, plus rapide et plus rentable. En modèles in vitro permettent également une enquête approfondie des interactions agent de cellules qui peuvent être difficiles à évaluer in vivo. Ces systèmes in vitro dans l'exposition sont rares et, en outre, dans certains modèles classiques où les agents toxiques sont ajoutées au milieu de culture dans lequel les cellules sont immergées, les propriétés des agents peuvent changer en raison des interactions et liaison aux composants dans le milieu. Dans de tels scénarios cellulaires des systèmes de culture tels que l'interface air-liquide (ALI) des cultures de cellules primaires épithéliales des voies respiratoires humaines, proposés ici, qui peuvent être directement exposés à des agents gazeux pourrait être prometteur.
Les cellules épithéliales qui tapissent les voies respiratoires sont les premières lignes de défense contre les produits chimiques toxiques inhalés. L'épithélium des voies respiratoires humaine constitue une barrière physique entre la lumière et les cellules sous-jacentes dans le poumon et participe à la réaction du poumon. Il produit un certain nombre de cytokines et d'autres agents pro-et anti-inflammatoires ainsi que sécrète le liquide de surface mucus / des voies respiratoires (ASL) recouvrant l'épithélium. Une des limitations à immergé conventionnelle dans les systèmes de culture in vitro est également que l'ASL et de mucus qui couvre la surface épithéliale est enlevé ou dilués. Cela ne reflète pas l'état physiologique des cellules épithéliales pulmonaires qui sont exposés à l'air. Ainsi, un idéal dans le système in vitro pour les tests de toxicité TIC devrait reproduire cette architecture. Il ya un grand intérêt dans le développement rapide de dépistage méthodes qui prédisent la toxicité in vivo. Les cellules épithéliales cultivées à l'ALI différencier et avoir des structures et des fonctions bien différenciées par rapport aux cellules cultivées submergés et servir un modèle supérieur des voies respiratoires.
Dans cette étude, nous décrivons l'utilisation de l'air liquide interface culture de voies respiratoires humaines (trachéo-bronchique) des cellules épithéliales pour tester toxique par inhalation de gaz toxiques et de le comparer avec une culture cellulaire immergé de cardiomyocytes, donc étudier une autre cible importante de la toxicité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le type le plus commun des expositions toxiques aigus se produit lorsque l'on respire un produit chimique toxique dans les poumons. Ces produits chimiques peuvent aussi être prises rapidement dans la circulation sanguine et peuvent avoir un impact d'autres organes tels que le cerveau et le cœur. Toxicité à l'inhalation de divers agents utilisant des modèles animaux sont étudiés et largement rapporté, mais les mécanismes sont moins bien compris. Il s'agit d'un obstacle majeur dans le dévelop…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche est soutenue par le Programme CounterACT, National Institutes of Health (NIH), Bureau du Directeur, et l'Institut national des sciences de la santé environnementale (NIEHS) Nombre Grant U54 ES015678 (MTE). SA est également soutenue par l'hôpital pour enfants de Colorado / Colorado School of Mines Collaboration Award pilote # G0100394 et Colorado Hospital Research Institute Award pilote n ° de G0100471 pour enfants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referenzen
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