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Biotechnik

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

Published: August 20, 2014
doi:
10.3791/51542
, , ,
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute,University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences,University at Albany, State University of New York

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

Ein großer Teil des menschlichen Genoms transkribiert wird, aber nicht übersetzt. In diesem Beitrag genomischen Ära, regulatorische Funktionen von RNA haben gezeigt, dass immer mehr wichtig zu sein. RNA-Funktion hängt oft von seiner Fähigkeit, alternative Strukturen annehmen, ist es schwierig, RNA dreidimensionale Strukturen direkt Sequenz vorherzusagen. Einzelmolekül Ansätze zeigen Potentiale, das Problem der RNA strukturellen Polymorphismus durch Überwachen Molekülstrukturen ein Molekül zu einem Zeitpunkt zu lösen. Diese Arbeit stellt eine Methode, um die Faltung und Struktur der einzelnen RNA-Moleküle mit Hilfe der optischen Pinzette gerade manipulieren. Erstens, Methoden zu synthetisieren Moleküle geeignet für Einzelmolekül-mechanische Arbeit werden beschrieben. Als nächstes werden verschiedene Eichverfahren, um die entsprechenden Operationen der optischen Pinzette sicherzustellen diskutiert. Als nächstes werden verschiedene Experimente erläutert. Um den Nutzen der Technik zu demonstrieren, Ergebnisse der mechanisch Entfaltung RNA Haarnadeln und ein einzelnes RNA Kissing Komplexes sind als Beweismittel verwendet. In diesen Beispielen wurde die Nanomanipulationstechnik verwendet, um das Falten der einzelnen Strukturdomäne, einschließlich sekundären und tertiären studieren unabhängig. Schließlich werden die Beschränkungen und zukünftige Anwendungen des Verfahrens diskutiert.

Introduction

Die Entwicklung der optischen Pinzette Technik seit langem mit ihrer Anwendung in der biologischen Forschung begleitet. Wenn das optische Falleneffekt zuerst entdeckt wurde, beobachtet Arthur Ashkin, dass Bakterien in verunreinigtem Wasser kann an der Laserfokus 1 gefangen werden. Seitdem, Trapping Bakterien hat sich zu einem unbeabsichtigten, lustiges Experiment für Generationen von Studenten der Biophysik sowie eine ernsthafte Recherche-Tool, um mikrobielle Physiologie 2,3 studieren. Das optische Einfangen Technik verwendet fokussierten Laserstrahls, um einen mikroskopischen Objekt 1 immobilisieren. Praktisch wird ein Laserfalle als ein optischer Feder, die auch Maßnahmen Kraft (F) auf dem eingeklemmten Gegenstand durch die Verschiebung von der Mitte der Falle (AX). Innerhalb kurzer Reichweite, F = κ x AX, in κ die Federkonstante der Falle. Die optische Falle kann verwendet werden, um Kraft in Pikonewton (pN) Präzision, um ein Micros auszuübenkopische Objekt und messen ihre Position mit Nanometer (nm) Genauigkeit. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben optische Pinzette zu einem der am häufigsten verwendeten Einzelmolekültechniken in der Biophysik. Die Technik wurde verwendet, um das Falten und Mechanik der DNA 4-6, 7-9 RNA und Proteine ​​10,11 studieren. Optische Pinzetten wurden auch verwendet, um die DNA-Replikation 12 13 RNA-Transkription und Proteinsynthese 14,15 sowie viele andere biomolekulare Ereignisse 16-18 beobachten.

In RNA Strukturforschung sind Einzelmolekül-Ansätze beschäftigt vor allem auf die robuste Klappenergielandschaft von RNA zu erkunden. Eine RNA-Sequenz kann in der Regel in mehrere stabile, sich gegenseitig ausschließende Strukturen falten, aufgrund der einfachen chemischen Zusammensetzung und Basenpaarung Regeln der RNA. Es ist seit langem bekannt, dass RNA strukturellen Polymorphismus, wie er in Riboswitches 19,20 auftritt, spielt eine wichtige Rolle bei der Genregulation. Ein Vor kurzet genomweite Umfrage hat ergeben, dass Temperaturschwankungen so gering wie ein paar Grad Struktur und die Proteinsynthese eines großen Teils des zellulären Transkriptoms 21 stark beeinflussen. Dieses Beispiel deutet an, dass die biologische Rolle von RNA-Faltung Alternative ist vielleicht noch wichtiger und durchdringend, als bisher angenommen. Struktur Polymorphismus jedoch eine Herausforderung für die traditionellen biochemischen und biophysikalischen Ansätzen, die durchschnittlichen Eigenschaften vieler Moleküle zu untersuchen. Zum Beispiel kann die "An" und "Aus"-Konformationen eines RNA-Schalter sich gegenseitig aus. Eine gemittelte Struktur von heterogenen Strukturen abgeleitet ist wahrscheinlich nicht eine der biologisch relevante Konformationen ähneln. Darüber hinaus untranslatierte RNA und mRNA bilden in der Regel Strukturen. Ihre Wechselwirkung mit Proteinen und regulatorischen RNAs häufig benötigt Entfaltung bestehende Struktur als Teil der Interaktion. Daher studieren RNA Entfaltung / Rückfaltung wird eine relevanteAusgabe von RNA Biologie. Um eine solche Herausforderung zu begegnen, hat die Einzelmolekül-Ansatz eingesetzt, um RNA-Struktur Polymorphismus durch das Studium ein Molekül in einer Zeit, 22-27 entwirren.

Im Vergleich zu den beliebten Einzelmolekülfluoreszenzverfahren, Pinzette basierend mechanische Entfaltung bietet den Vorteil, dass Konformationen einzelner Moleküle können durch angelegte Kraft manipuliert werden und mit Nanometer-Präzision gemessen werden. Diese Nanomanipulationsfähigkeit kann verwendet werden, um das Aufklappen / Zusammenklappen der einzelnen strukturellen Domänen, so daß die hierarchische Falten eines großen RNA präpariert 28 werden überwacht. Alternativ kann ein einzelner Strang gerichtet, in eine von mehreren Konformere zu falten; oder eine bestehende Struktur mechanisch induziert werden, um in eine andere Konformation 29 falten. Unter biologischen Bedingungen kann eine RNA-Struktur bei Temperaturänderung oder die Ligandenbindung verändert werden. Die Fähigkeit direkt zu bearbeiten Molekular struktur öffnet eine neue Spielstätte der RNA-Struktur Studie. Grundsätzlich andere mechanische Techniken wie Rasterkraftmikroskop und magnetische Pinzette, können auch verwendet werden, um das Falten der einzelnen RNA-Moleküle zu untersuchen. Jedoch sind solche Anwendungen weitgehend aufgrund der relativ niedrigen räumlichen Auflösung 30 begrenzt.

Der Einsatz von optischen Pinzetten können RNA-Strukturen, um durch mechanische Kraft entfaltet werden.

Der Vorteil der mechanischen Entfaltung ist mehrfach. Kraft kann verwendet werden, um die sekundäre und die tertiäre Strukturen entfalten, wobei Metallionen und Liganden-induzierte Falten sind hauptsächlich tertiäre Strukturen beschränkt. Temperatur und Denaturierungsmittel kann erhebliche Auswirkungen auf die Aktivitäten von Wasser und gelöste Stoffe. Im Gegensatz dazu wird die Kraft lokal auf molekularer Strukturen stören aufgebracht; Die Krafteinwirkung auf die Umgebung vernachlässigbar ist. Darüber hinaus wird die thermische Schmelz besten verwendet, um das Falten der Thermodynamik von kleinen RNA-Strukturen zu untersuchen,wohingegen optische Pinzetten wurden verwendet, um RNA-Strukturen mit verschiedenen Größen zu untersuchen, die von einem Sieben-Basenpaar-Haarnadel Tetraloop 28 zu einem 400-Nukleotid-Ribozym 31. Ferner kann RNA-Strukturen mechanisch mesophilen Temperaturen entfaltet werden. Im Gegensatz zu RNAs in einem thermischen Schmelzexperiment zu entfalten, wird die Temperatur in der Regel deutlich über physiologischen Temperaturen, die deutlich erhöht RNA-Hydrolyse, insbesondere in Gegenwart von Mg 2 +-Ionen erhöht.

Es ist wichtig zu beachten, dass die mechanische Wirkung der Kraft abhängig, wie es sich auf eine Struktur angewendet wird. Die aufgebrachte Kraft kippt die Falten Energielandschaft. Zum Beispiel, wenn eine Kraft auf eine Haarnadel aufgebracht wird, die Basenpaare nacheinander gebrochen, eine zu einem Zeitpunkt (Abbildung 1a). Die Rippen Gabel schreitet entlang der Schraubenachse, die senkrecht zu der aufgebrachten Kraft ist. Wenn dagegen eine minimale küssen Komplex ist unter Spannung, die beiden küssenBasenpaare, die parallel zu der aufgebrachten Kraft sind, teilen sich die Kraftbelastung (Abbildung 1b). Die unterschiedlichen Geometrien der Haarnadel und kissing Komplexes relativ zu der aufgebrachten Kraft infolge ihrer unterschiedlichen mechanischen Resonanz, die verwendet werden kann, um sekundäre und tertiäre Faltung 28,32 unterscheiden. Der theoretische Aspekt der mechanischen Entfaltung zuvor überprüft worden 8,9,30. Diese Arbeit werden die grundlegenden Ansätze zur Einrichtung und führen Sie eine Einzelmolekül-mechanische Entfaltung Assay.

Versuchsaufbau. In unserem mechanisches Ziehen Experiment wurde die RNA-Probe für Pinzetten aus der RNA von Interesse durch zwei doppelsträngige DNA / RNA flankiert Griffe (2) 7. Das gesamte Molekül kann zwei oberflächenbeschichteten Mikrometergröße Kügelchen (Spherotech) über Streptavidin-Biotin-und Digoxigenin-anti-Digoxigenin-Antikörper-Wechselwirkungen bzw. angebunden werden. Einem Wulst wird durch einen Kraftmess optischen tr gehaltenAP, während die andere an der Spitze einer Mikropipette gehalten. Der relative Abstand zwischen den Kügelchen können entweder durch die Steuerung der Falle oder Bewegen der Mikropipette geändert werden. Mit diesem Ansatz kann ein einzelnes RNA-Molekül Tethering die Perlen gedehnt und entspannt werden.

Herstellung der Proben. Die Synthese von RNA-Proben zum Zupfen beinhaltet einige Schritte (Abbildung 3). Zuerst wird die DNA-Sequenz, die dem RNA von Interesse zuerst in einen Plasmidvektor kloniert. Als nächstes werden drei PCR Reaktionen durchgeführt, um die zwei Handgriffe und eine Vorlage für die Transkription zu erzeugen. Die Transkription Vorlage umfasst die Griff Regionen und die eingefügten Sequenzen. Der Volllängen-RNA wird durch in vitro-Transkription synthetisiert. Zuletzt werden die RNA und chemisch modifizierte Griffe zusammen getempert, um die Moleküle zu zupfen erzeugen.

Kalibrierung und Betrieb der Pinzette. Das grundlegende Design des Minitweezers Einsatzd in dieser Arbeit folgt, dass der Dual-Beam-optischen Pinzette 33. Mit vielen Verbesserungen, die Minitweezers anzuzeigen außergewöhnliche Stabilität im Vergleich zur ersten Generation optischen Pinzette. Eine Reihe von Forschungsgruppen in mehreren Ländern die Minitweezers verwenden in ihren Einzelmolekül-Forschung 14,15,34-37. Die Details der Konstruktion, Kalibrierung und Betrieb des Gerätes, einschließlich Lehrvideos, sind in der "Pinzette Lab"-Website (http://tweezerslab.unipr.it) zur Verfügung. Dabei sind Verbesserungen und Kalibrierungsverfahren, die auf täglicher Basis durchgeführt werden müssen, im Detail beschrieben.

Protocol

1. Vorbereitung von RNA-Molekülen für Einzelmolekül-zupfen Klonieren der Sequenz von Interesse. Klonierung der DNA-Sequenz, die dem RNA-Struktur in einen Vektor. Synthese und Reinigung der Transkriptionsvorlage. Synthetisieren eine Transkription Vorlage durch PCR. [Ort Tabelle 1 hier] nächstes reinigen die PCR-Produkte mit Hilfe eines PCR-Reinigungs-Kits, und konzentrieren sich die Probe auf> 200 ng / ul. Weil die gereinigte DNA wird für die Transkription verwendet wird, sollte RNase freies …

Representative Results

Durch den Raum begrenzt ist, wird Nanomanipulation von einzelnen RNA-Moleküle, die durch die nur mechanische Entfaltung Beispiele für RNA-Haarnadeln und ein RNA mit Tertiärstruktur demonstriert. Manipulieren Einzel Hairpin Moleküle Sobald ein Halteseil zwischen den Perlen hergestellt ist, kann Verlängerung und Kraft auf das Halteseil mit einem Benutzer-definierten Protokoll bearbeitet werden. Vier gemeinsamen Manipulation Protokolle werden h…

Discussion

Umbau und Fehlerbehebung in Vorbereitung der Proben Tweezing

Wahl des Klonens von Vector. Obwohl die hier beschriebenen allgemeinen Schema (Figur 3) erfordert keine besondere Klonierungsvektor wird der Vektor bevorzugt, keine intrinsische T7 oder T3-Promotor für die Leichtigkeit der Transkription, so dass ein Promotor mittels PCR an den gewünschten Positionen eingebracht werden müssen.

Reihenfolge und Länge…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

Materials

Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D
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Referenzen

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Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. X. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).
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