Наноманипулирование Единого РНК молекул на оптический пинцет
Summary
Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.
Abstract
Большая часть человеческого генома транскрибируется, но не переведены. В этом почтовом геномной эры, регуляторные функции РНК, как было показано, чтобы быть более важным. В функции РНК часто зависит от его способности принимать альтернативные структуры, трудно предсказать РНК трехмерные структуры непосредственно из последовательности. Одиночных молекул подходы показывают потенциал для решения проблемы РНК структурной полиморфизма путем мониторинга молекулярных структур одну молекулу в то время. Эта работа представляет собой метод, чтобы точно управлять складывание и структуру отдельных молекул РНК с использованием оптических пинцет. Во-первых, методы синтеза молекулы, пригодные для одиночных молекул механическую работу описаны. Обсуждаются Следующая, различные процедуры калибровки для обеспечения надлежащей работы оптического пинцета. Далее, различные эксперименты объясняются. Чтобы продемонстрировать полезность техники, результаты механически разворачивающихся РНК шпильки и одна РНК целуемсяг комплекс используются в качестве доказательств. В этих примерах, техника наноманипулирование был использован для изучения складывания каждого структурного домена, в том числе вторичные и третичные, независимо. Наконец, обсуждаются ограничения и будущие применения метода.
Introduction
Развитие оптического пинцета техники уже давно сопровождается ее применения в биологических исследованиях. Когда оптический эффект захвата был впервые обнаружен, Артур Ashkin заметил, что бактерии в загрязненной воде может оказаться в ловушке в фокусе лазера 1. С тех пор, бактерии пленения стала непреднамеренным, забавный эксперимент для поколений студентов биофизики, а также серьезный инструмент исследования для изучения микробного физиологию 2,3. Техника оптического захвата использует сфокусированный лазерный луч, чтобы обездвижить микроскопический объект 1. Практически, лазерной ловушки функционирует как оптического источника, который также измеряет силу (F) на захваченного объекта путем его перемещения от центра ловушки (АХ). В течение короткого диапазона, F = κ х АХ, в κ постоянная пружины из ловушки. Оптическая ловушка может быть использован, чтобы оказывать усилие в picoNewton (PN) точностью до микроскопииОбъект Copic и измерить его положение с нанометровой (нм) точности. В последние два десятилетия, оптический пинцет стали одним из наиболее часто используемых методов одиночных молекул в биофизике. Техника использовалась для изучения складывания и механику ДНК 4-6, РНК 7-9, и белков 10,11. Оптический пинцет также использовались для наблюдения репликации ДНК 12, транскрипции РНК 13, и синтез белка 14,15, а также многие другие биомолекулярные события 16-18.
Одиночных молекул подходы используются в РНК структурных исследований главным образом для изучения прочный складной энергетический ландшафт РНК. Последовательность РНК, как правило, раз в несколько стабильных, взаимоисключающих структур, в связи с простых химического состава и база Paring правил РНК. Давно известно, что РНК структурный полиморфизм, как, например, происходит в riboswitches 19,20, играет важную роль в регуляции генов. Recenт генома опрос показал, что колебания температуры как малые, как на несколько градусов существенно повлиять структуры и синтез белка в значительной части клеточного транскриптома 21. Этот пример подсказывает, что биологическая роль альтернативного РНК складывания, пожалуй, более важным и распространенным, чем предполагалось ранее. Структурная полиморфизм, однако, представляет собой вызов для традиционных биохимических и биофизических подходов, которые рассматривают средние свойства многих молекул. Например, "на" и "выключено" конформации riboswitch являются взаимоисключающими. Среднем структура получена из гетерогенных структур, вероятно, не похожи на любой из биологически соответствующих конформеров. Кроме того, нетранслируемая РНК и мРНК обычно образуют структуры. Их взаимодействие с белками и регулирующих РНК обычно требуется раскрытие существующей структуры в рамках взаимодействия. Поэтому, изучая РНК разворачивается / повторной укладки становится уместенВопрос РНК биологии. Для удовлетворения такой вызов, подход одиночных молекул был использован, чтобы разгадать РНК структурный полиморфизм, изучая одну молекулу в то время 22-27.
По сравнению с популярным методом флуоресцентной одиночных молекул, пинцет, основанные механическая разворачивается предлагает преимущество, что конформации отдельных молекул можно управлять с помощью приложенной силы и быть измерена с нанометровой точностью. Эта возможность наноманипулирование могут быть использованы для мониторинга разворачивается / складной отдельных структурных доменов таким образом, что иерархическое складывание большого РНК можно разрезать 28. Кроме того, одной нити могут быть направлены на сгиб в одном из нескольких конформеров; или Существующая структура может быть механически индуцированной чтобы повторно сворачивают в другую конформацию 29. В биологических условиях, структура РНК может быть изменен на изменение температуры или связывание лиганда. Возможность непосредственного использования молекулярных стуру открывает новую площадку РНК структурной исследования. В принципе, другие механические методы, такие как атомного микроскопа силы и магнитных пинцетов, также может быть использован для изучения складывания отдельных молекул РНК. Тем не менее, такие приложения ограничиваются в основном за счет относительно низкой пространственной разрешающей 30.
Применение оптического пинцета позволяет РНК структуры, чтобы быть развернута по механической силы.
Преимущество механической разворачивается в несколько раз. Сила может быть использован, чтобы развернуть как вторичные и третичные структуры, тогда как металлические ионы и лигандом индуцированного складывающиеся в основном ограничивается третичных структур. Температура и денатуранта могут существенно влиять на деятельность воды и растворенных веществ. В отличие от этого, сила прикладывается локально, чтобы возмущать молекулярных структур; Эффект силы на окружающую среду можно пренебречь. Кроме того, тепловое плавления лучше всего использовать для изучения сворачивания термодинамики малых структур РНК,в то время как оптический пинцет были использованы для изучения РНК структуры с различными размерами в диапазоне от семи пар оснований tetraloop шпильки 28 до 400 нуклеотидов рибозима 31. Кроме того, РНК структуры могут быть механически развернулась в мезофильных температурах. В отличие от этого, разворачиваться РНК в эксперименте теплового плавления, температура, как правило, поднят значительно выше физиологических температурах, что существенно увеличивает гидролиз РНК, особенно в присутствии ионов Mg2 +.
Важно отметить, что механическое действие силы зависит от того, как оно применяется к структуре. Приложенная сила наклоняет складной энергетический ландшафт. Например, когда сила приложена к шпильке, что пар оснований последовательно разбиты, по одному за раз (фиг.1а). Копирования вилки прогрессирует по винтовой оси, перпендикулярной к приложенной силе. В отличие от этого, когда минимальное поцелуи комплекс находится под натяжением, два целоватьсяпар оснований, которые параллельны приложенной силы, распределить нагрузку силы (1б). Различные геометрии шпильке и целуя комплекса по отношению к приложенной силы в результате их различных механических ответ, который может быть использован, чтобы отличить вторичную и третичную складывание 28,32. Теоретико аспект механической разворачивается ранее отзывы 8,9,30. Эта работа излагаются основные подходы по созданию и выполнить один-молекулы механическую разворачивается анализа.
Экспериментальная установка. В нашей механической потянув эксперимента, РНК образец для выщипывания состоит из РНК интереса в окружении двух двухцепочечными ручками ДНК / РНК (рисунок 2) 7. Вся молекула может быть привязан к двум бисером микронного размера поверхностных покрытием (SPHEROTECH) через стрептавидин- биотина и дигоксигенином анти-дигоксигенин антител взаимодействий, соответственно. Один шарик удерживается измерения усилия оптической трап, в то время как другой проводится на кончике микропипеткой. Относительное расстояние между шариков может быть изменено либо рулевой ловушку или перемещение микропипетки. Используя этот подход, одна молекула РНК привязывать шарики могут быть растянуты и расслаблены.
Получение образцов. Синтез образцов РНК для выщипывания включает несколько шагов (рисунок 3). Сначала ДНК-последовательность, соответствующую РНК интереса сначала клонировали в плазмидный вектор. Далее, три ПЦР-реакции выполняются генерировать две ручки и шаблон для транскрипции. Шаблон транскрипции охватывает ручки регионы и вставленные последовательности. Полная длина РНК синтезировали с помощью транскрипции в пробирке. Последние, РНК и химически модифицированные ручки отжигают вместе, чтобы сформировать молекулы для выщипывания.
Калибровка и эксплуатация Пинцет. Базовая конструкция использованием Minitweezersд в этой работе следует, что из двойного пучка оптического пинцета 33. Со многими улучшения, Minitweezers отображения чрезвычайной устойчивостью по сравнению с оптического пинцета первого поколения. Ряд научно-исследовательских групп в ряде стран использовать Minitweezers в своих исследованиях одиночных молекул 14,15,34-37. Детали конструкции, калибровки и работы устройства, в том числе инструкции видео, доступны на веб-сайте "Пинцет Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Здесь, улучшения и процедуры калибровки, которые должны быть выполнены на ежедневной основе, описаны в деталях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модификация и устранение неисправностей в подготовке выщипывания Образцы
Выбор вектора клонирования. Хотя общая схема описано здесь (фиг.3) не требует специального клонирующий вектор, вектор предпочтительно не имеют внутреннюю Т7 или Т3 промо?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.
Materials
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
Referenzen
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
- Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
- Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. . Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, 795-799 (1996).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. . The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, 1835-1837 (1996).
- Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
- Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J, C., Bustamante, . Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, 733-737 (2001).
- Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
- Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
- Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. . Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, 2057-2060 (2005).
- Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
- Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
- Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
- Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Pease, P. J., et al. . Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, 586-590 (2005).
- Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
- Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
- Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
- Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
- Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
- Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
- Wood, S., Ferre-D’Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
- Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemie. 49, 1596-1605 (2010).
- Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. . Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, 630-633 (2008).
- Frieda, K. L., Block, S. M. . Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, 397-400 (2012).
- Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
- Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
- Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
- Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
- Onoa, B., et al. . Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, 1892-1895 (2003).
- Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
- Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
- Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
- Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. . The ribosome modulates nascent protein folding. 334, 1723-1727 (2011).
- Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
- Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
- Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
- Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
- Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
- Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
- Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
- Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemie. 52, 4991-5001 (2013).
- Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
- Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
- Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
- Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
- Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
- Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. . Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, 2175-2188 (2007).
- Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
- Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).
