Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas
Summary
Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.
Abstract
Una gran parte del genoma humano se transcribe pero no se traduce. En esta era post genómica, las funciones de regulación de ARN se ha demostrado ser cada vez más importante. Como la función del ARN a menudo depende de su capacidad para adoptar estructuras alternativas, es difícil predecir de ARN estructuras tridimensionales directamente de secuencia. Single-molécula se acerca mostrar potenciales para resolver el problema de la ARN polimorfismo estructural mediante el control de las estructuras moleculares de una molécula a la vez. Este trabajo presenta un método para manipular con precisión el plegamiento y la estructura de las moléculas de ARN individuales utilizando pinzas ópticas. En primer lugar, los métodos para sintetizar moléculas adecuadas para una sola molécula trabajo mecánico se describen. Se discuten, varios procedimientos de calibración siguientes para garantizar las operaciones propias de las pinzas ópticas. A continuación, se explican varios experimentos. Para demostrar la utilidad de la técnica, los resultados de desplegar mecánicamente horquillas de ARN y un único ARN kissing complejo se utilizan como evidencia. En estos ejemplos, se utilizó la técnica nanomanipulación para estudiar el plegado de cada dominio estructural, incluyendo secundaria y terciaria, de forma independiente. Por último, se discuten las limitaciones y futuras aplicaciones del método.
Introduction
El desarrollo de la técnica de las pinzas ópticas mucho tiempo se ha acompañado de su aplicación en la investigación biológica. Cuando el efecto de atrapamiento óptico fue descubierto por primera vez, Arthur Ashkin observó que las bacterias en el agua contaminada podrían quedar atrapados en el foco de láser 1. Desde entonces, las bacterias trapping se ha convertido en una, divertido experimento no intencional para las generaciones de estudiantes biofísica, así como una herramienta de investigación serio para estudiar la fisiología microbiana 2,3. La técnica de captura óptica utiliza rayo láser enfocado para inmovilizar un objeto microscópico 1. Prácticamente, una Trampa de láser funciona como un resorte óptico, que también mide la fuerza (F) en el objeto atrapado por su desplazamiento desde el centro de la trampa (Delta X). Dentro de un corto rango, F = κ x Delta X, en κ es la constante del resorte de la trampa. La trampa óptica se puede utilizar para ejercer la fuerza en picoNewton (PN) a una precisión microsobjeto copic y medir su posición con nanómetros (nm) de precisión. En las últimas dos décadas, las pinzas ópticas se han convertido en una de las técnicas de una sola molécula más utilizados en biofísica. La técnica se ha empleado para estudiar el plegado y la mecánica de ADN 4-6, 7-9 ARN, y proteínas 10,11. Las pinzas ópticas también se han utilizado para observar la replicación del ADN 12, la transcripción del RNA 13, y la síntesis de proteínas 14,15, así como muchos otros eventos biomoleculares 16-18.
Se emplean enfoques sola molécula en investigación estructural ARN principalmente para explorar el paisaje de energía plegable resistente de ARN. Una secuencia de ARN normalmente puede plegarse en múltiples estructuras estables, mutuamente excluyentes, debido a la composición química y de pelado de base de reglas simples de ARN. Durante mucho tiempo se ha sabido que el ARN polimorfismo estructural, como la que se produce en riboswitches 19,20, juega un papel importante en la regulación génica. Una recent encuesta en todo el genoma ha revelado que las variaciones de temperatura de hasta unos pocos grados influyen en gran medida la estructura y la síntesis de proteínas de una gran parte del transcriptoma celular 21. Este ejemplo sugiere que el papel biológico de ARN plegables alternativa es tal vez más importante y generalizada que se suponía. Polimorfismo estructural, sin embargo, plantea un desafío para los enfoques bioquímicos y biofísicos tradicionales, que examinan las propiedades promedio de muchas moléculas. Por ejemplo, el "on" y conformaciones "off" de un riboswitch son mutuamente excluyentes. Una estructura de un promedio de derivado de estructuras heterogéneas no es probable que se asemejan a cualquiera de los confórmeros biológicamente relevantes. Por otra parte, ARN no traducido del ARNm y generalmente se forman estructuras. Su interacción con las proteínas y ARNs reguladores comúnmente requiere despliegue de la estructura existente como parte de la interacción. Por lo tanto, el estudio de RNA de desplegamiento / replegamiento se convierte en un pertinentecuestión de la biología de ARN. Para afrontar este reto, el enfoque de una sola molécula se ha empleado para desentrañar ARN polimorfismo estructural mediante el estudio de una molécula a la vez 22-27.
En comparación con el método de fluorescencia de una sola molécula popular, pinzas basados despliegue mecánico ofrece la ventaja de que las conformaciones de las moléculas individuales se pueden manipular por la fuerza aplicada y ser medidos con precisión nanométrica. Esta capacidad nanomanipulación puede ser utilizado para controlar el despliegue / plegado de dominios estructurales individuales tales que el plegado jerárquica de un gran ARN puede ser disecado 28. Alternativamente, una sola hebra puede ser dirigida a plegarse en uno de varios confórmeros; o una estructura existente puede ser inducida mecánicamente a replegarse en una conformación diferente 29. Bajo condiciones biológicas, una estructura de ARN puede ser alterado al cambiar la temperatura o la unión del ligando. La capacidad de manipular directamente s molecularestructure abre un nuevo espacio de estudio estructural del ARN. En principio, otras técnicas mecánicas, tales como microscopio de fuerza atómica y pinzas magnéticas, también se pueden utilizar para estudiar el plegado de las moléculas de ARN individuales. Sin embargo, tales aplicaciones se limitan en gran parte debido a la relativamente baja resolución espacial 30.
El empleo de pinzas ópticas permite estructuras de ARN que se desplegaron por la fuerza mecánica.
La ventaja de mecánica despliegue es varias veces. La fuerza puede ser utilizado para desplegar tanto estructuras secundarias y terciarias, mientras que los iones de metal y ligando inducida plegado se limitan principalmente a estructuras terciarias. La temperatura y la desnaturalizante pueden afectar significativamente las actividades de agua y solutos. En contraste, la fuerza se aplica localmente para perturbar las estructuras moleculares; el efecto de la fuerza sobre el medio ambiente circundante es despreciable. Además, se utiliza mejor de fusión térmico para estudiar la termodinámica de plegado de las pequeñas estructuras de ARN,mientras que las pinzas ópticas se han utilizado para estudiar las estructuras de ARN con diversos tamaños, que van desde un tetraloop horquilla de siete pares de bases 28 a un ribozima 400-31 nucleótidos. Además, las estructuras de ARN se pueden desplegar mecánicamente a temperaturas mesófilas. En contraste, se desarrolle ARN en un experimento de fusión térmica, la temperatura se eleva típicamente muy por encima de las temperaturas fisiológicas, lo que aumenta significativamente la hidrólisis de ARN, especialmente en presencia de iones Mg 2 +.
Es importante señalar que el efecto mecánico de la fuerza depende de cómo se aplica a una estructura. La fuerza aplicada inclina el plegado panorama energético. Por ejemplo, cuando se aplica una fuerza a una horquilla, los pares de bases se rompen secuencialmente, uno a la vez (Figura 1a). El tenedor rasga progresa a lo largo del eje de la hélice, que es perpendicular a la fuerza aplicada. En contraste, cuando un complejo mínima besos está bajo tensión, los dos besarpares de bases, que son paralelas a la fuerza aplicada, comparten la carga de fuerza (figura 1b). Las diferentes geometrías de la horquilla y besar complejo relativa al resultado fuerza aplicada en su diferente respuesta mecánica, que puede ser utilizado para distinguir plegado secundaria y terciaria 28,32. El aspecto teórico de la mecánica despliegue ha sido revisado previamente 8,9,30. Este trabajo describe los enfoques básicos para configurar y realizar una sola molécula de ensayo de desarrollo mecánico.
Configuración Experimental. En nuestro experimento tracción mecánica, la muestra de ARN para la depilación con pinzas consiste en el ARN de interés flanqueada por dos asas de doble hebra de ADN / ARN (Figura 2) 7. La molécula entera puede ser atado a dos perlas de micras de tamaño con recubrimiento de superficie (Spherotech) a través de estreptavidina-biotina y digoxigenina interacciones anticuerpo-anti-digoxigenina, respectivamente. Un grano está en manos de un tr óptico de medición de fuerzaap, mientras que el otro se mantiene en la punta de una micropipeta. La distancia relativa entre las perlas se puede cambiar por cualquiera de dirigir la trampa o mover la micropipeta. Usando este enfoque, una sola molécula de ARN tethering las perlas puede ser estirado y relajado.
Preparación de las muestras. La síntesis de RNA de muestras para la depilación con pinzas incluye algunos pasos (Figura 3). En primer lugar, la secuencia de ADN correspondiente al ARN de interés se clona primero en un vector plasmídico. A continuación, tres reacciones de PCR se llevan a cabo para generar las dos asas y una plantilla para la transcripción. La plantilla de la transcripción abarca las regiones de la manija y las secuencias insertadas. El ARN de longitud completa se sintetiza por transcripción in vitro. Por último, el ARN y las manijas modificados químicamente son recocidos juntos para generar las moléculas para la depilación con pinzas.
Calibración y Operación de pinzas. El diseño básico de la utilización Minitweezersd en este trabajo se desprende que de las pinzas ópticas de doble haz 33. Con muchas mejoras, los Minitweezers mostrar una estabilidad extraordinaria en comparación con las pinzas ópticas primera generación. Un número de grupos de investigación en varios países utilizan las Minitweezers en sus investigaciones de una sola molécula 14,15,34-37. Los detalles de construcción, calibración y operación del dispositivo, incluyendo videos de instrucción, están disponibles en el sitio web "Pinzas Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Aquí, las mejoras y los procedimientos de calibración que deban llevarse a cabo en bases diarias se describen en detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificación y resolución de problemas en la preparación de muestras Tweezing
Elección de clonación del vector. Aunque el esquema general descrito aquí (Figura 3) no requiere un vector de clonación especial, se prefiere el vector no tener T7 intrínseca o promotor T3 para la facilidad de la transcripción de tal manera que un promotor puede ser introducido a través de PCR en las posiciones deseadas.
Sec…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.
Materials
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
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