光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

ヒトゲノムの大部分は転写されるが翻訳されていません。このポストゲノム時代においては、RNAの調節機能は、ますます重要であることが示されている。 RNAの機能は、多くの場合、別の構造を採用する能力に依存するので、シーケンスから直接RNA三次元構造を予測することは困難である。単一分子は、一度に一つの分子の分子構造を監視することにより、RNA構造多型の問題を解決するためにショーの電位に近づく。この作品は、正確に光ピンセットを用いて単一のRNA分子のフォールディングおよび構造を操作するための手法を提案する。まず、単一分子力学的仕事に適した分子を合成する方法が記載されている。次に、光ピンセットの業務の適正を確保するために、さまざまなキャリブレーション手順が説明されています。次に、さまざまな実験が説明されている。技術の有用性を実証するために、機械的に展開するRNAヘアピンの結果や単一のRNAキーシングラム複合体は証拠として使用される。これらの例では、ナノマニピュレーション技術は、独立して、二次および三次構造を含む各ドメインのフォールディングを研究するために使用した。最後に、制限及び方法の将来のアプリケーションが説明されています。

Introduction

光ピンセット技術の開発は、長い生物学的研究におけるその適用を伴っている。光閉じ込め効果が最初に発見された場合には、アーサーAshkinは汚染された水の中の細菌は、レーザーの焦点¹に捕捉することができたことを観察した。それ以来、トラッピング細菌は生物物理学の学生の世代のために意図的で、楽しい実験だけでなく、微生物生理学^2,3を研究するため^の本格的な研究ツールとなっています。光トラッピング技術は、顕微鏡対象物^1を固定する集束レーザービームを使用する。実際には、また、トラップ（ΔX）の中心からの変位によって挟み込まれた物体に作用する力（F）を測定する光学春、などのレーザートラップ機能。短距離、F =κのxΔX内では、κトラップのバネ定数である。光トラップは、ミクロスにピコニュートン（pNで）精度の力を発揮するために使用することができコピックオブジェクトとナノメートル（nm）の精度でその位置を測定します。過去20年間では、光ピンセットは、生物物理学の中で最も使用された単一分子技術の一つとなっている。技術は、DNA ^{4-6、7-9、RNA}およびタンパク質^10,11の折り畳みおよび力学を研究するために採用されている。光ピンセットはまた、DNA複製^12、RNA転写^13、及びタンパク質合成^14,15、ならびに多くの他の生体分子のイベント^16-18を観察するために使用されている。

単一分子アプローチは主にRNAの頑丈なフォールディングエネルギー地形を探索するRNA構造的研究に用いられている。 RNA配列は、通常によるRNAの単純な化学組成及びベースペアリングルールに、複数の安定した、相互に排他的な構造に折り畳むことができる。これは、長いRNA構造多型、すなわちリボスイッチ^19,20に生じるような、遺伝子調節において重要な役割を果たしていることが知られている。 recenトンゲノムワイドの調査では数度と小さい温度変動が大きく、携帯トランスクリプトーム²¹の大部分の構造とタンパク質合成に影響を与えることを明らかにした。この例では、選択的RNAフォールディングの生物学的役割は、以前に想定よりもおそらくもっと重要かつ普及していることを示唆し。構造的多型は、しかし、多くの分子の平均的性質を調べ、従来の生化学的および生物物理学的アプローチ、のための課題を提起する。たとえば、「オン」とリボスイッチの「オフ」のコンホメーションは、相互に排他的です。異質の構造に由来し、平均化構造は、生物学的に関連する配座異性体のいずれかに似ている可能性は低い。また、非翻訳RNAおよびmRNAは通常、構造を形成する。タンパク質や調節RNAとの相互作用は、一般的な相互作用の一部として、既存の構造のアンフォールディングが必要です。そのため、RNAフォールディング/リフォールディングを研究することは、該当になるRNA生物学の問題。そのような課題に対応するために、単一分子アプローチは、時間^22〜27時、一分子を研究することによって、RNAの構造多型を解明するために採用されている。

人気のある単一分子蛍光法と比較して、アンフォールディング機械ベースのピンセットは、個別の分子の立体配座は、加えられた力によって操作することができ、ナノメートルの精度で測定するという利点を提供する。このナノマニピュレーション能力は、大きなRNAの階層的なフォールディングが^28を解剖することができるように個別の構造ドメインのアンフォールディング/フォールディングをモニターするために利用することができる。あるいは、一本鎖は、いくつかの配座異性体の一方に折り畳むように指示することができます。または既存の構造は、機械的に異なるコンフォメー²⁹内にフォールディングするように誘導することができる。生物学的条件下で、RNA構造は、温度変化またはリガンドの結合の際に変化させることができる。直接操作する分子の能力体制は、RNAの構造研究の新しい会場をオープンします。原則として、そのような原子間力顕微鏡、磁気ピンセットのような他の機械的技術もまた、単一のRNA分子のフォールディングを研究するために使用することができる。しかし、このようなアプリケーションは、主に、比較的低い空間分解能³⁰に制限されている。

光ピンセットの雇用は、RNA構造は機械的な力で展開することができます。

機械的な展開の利点は数倍である。金属イオンと配位子誘起フォールディングは主三次構造に限定されるのに対し、力は、二次および三次構造の両方を展開するために使用することができる。温度と変性剤が大幅に水と溶質の活動に影響を与えることができる。対照的に、力が分子構造を乱す局所的に適用される。周辺環境への力の影響は無視できる。また、熱溶融が最高の小さなRNA構造のフォールディングの熱力学を研究するために使用され、光ピンセットは、7塩基対テトラループヘアピン²⁸から400ヌクレオチド、リボザイム³¹に至るまで、さまざまなサイズのRNA構造を研究するために使用されているのに対し。さらに、RNA構造は、機械的に中温の温度で展開することができる。対照的に、熱融解実験でRNAを展開するために、温度は、典型的にはかなりよく、特にはMg ^{2 +}イオンの存在下で、RNAの加水分解を増大させる生理学的温度、より高くなる。

これは、力の機械的効果は、それが構造に適用される方法に依存することに留意することが重要である。加えられる力は折りたたみエネルギー地形を傾斜させる。例えば、力がヘアピンに適用した場合に、塩基対を順次、時間（ 図1a）少なくとも一つを破壊される。リッピングフォークは、加えられた力に垂直な螺旋軸に沿って進行する。最小限キス錯体は張力下にあるときとは対照的に、二つのキス加えられた力に平行な塩基対は、力の負荷を共有する（ 図1b）。異なるヘアピンの形状及び二次及び三次折り畳み^28,32を区別するために利用することができ、それらの異なる機械的応答して、加えられた力の結果に複素比キス。メカニカルアンフォールディングの理論的側面 ​​は、以前に^8,9,30概説され^ている。この作品は、設定および単一分子機械的アンフォールディングアッセイを実行するための基本的な方法の概要を説明します。

実験のセットアップ 。私たちの機械的引っ張りの実験では、ピンセットのためのRNA試料は二つの二本鎖DNA / RNAハンドルが隣接し、目的のRNA（ 図2）で構成されて^7。分子全体は、それぞれ、ストレプトアビジン – ビオチンおよびジゴキシゲニン – 抗ジゴキシゲニン抗体相互作用を介して2つの表面コートされたミクロンサイズのビーズ（Spherotech）に係留することができる。一つのビーズは、力測定光学TRに保持されているAPが、他方はマイクロピペットの先端に保持されている。ビーズ間の相対距離は、トラップを操縦またはマイクロピペットを移動させることのいずれかによって変更することができる。このアプローチを使用して、ビーズをテザリング単一のRNA分子が引き伸ばされ、緩和することができる。

試料の調製 。ピンセットのためのRNA試料の合成は、いくつかの手順（ 図3）を含む。まず、関心対象のRNAに対応するDNA配列は、第一のプラスミドベクターにクローニングする。次に、3つのPCR反応は、2つのハンドルおよび転写のための鋳型を生成するために実行される。転写鋳型は、ハンドル領域および挿入された配列を包含する。全長RNAをin vitro転写により合成される。最後に、RNA及び化学的に修飾されたハンドルは、ピンセットのための分子を生成するために一緒にアニールされる。

キャリブレーションとピンセットの動作 。 Minitweezers利用の基本設計この作品におけるdはデュアルビーム光ピンセット³³のことに従います。第一世代の光ピンセットに比べて多くの改善により、Minitweezers臨時安定性を示す。いくつかの国の研究グループの数は、それらの単一分子研究^14,15,34-37にMinitweezersを使用しています。命令ビデオを含む建設、キャリブレーション、デバイスの動作の詳細は、「ピンセットラボ」のウェブサイト（http://tweezerslab.unipr.it）でご利用いただけます。ここで、毎日の塩基で実行する必要の改良や校正手順について詳細に説明する。

Protocol

単一分子ピンセットのためのRNA分子の調製目的の配列のクローニング。ベクターへのRNAの構造に対応するDNA配列をクローニングする。 合成および転写鋳型の精製。 PCRによる転写鋳型を合成する。 [ここで、プレース表1]次に、PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、> 200 ngの/μlのサンプルを濃縮する。精製されたDNAを転写するために使用されているため、RNaseを含まない水が?…

Representative Results

スペースによって制限される、単一のRNA分子のナノマニピュレーションは、RNAヘアピン構造および三次構造を有するRNAの唯一の機械的な展開例を示すことにより実証される。 シングルヘアピン分子を操作する テザーは、ビーズ間で確立されると、テザー上の拡張力は、ユーザ定義のプロトコールを使用して操作することができる。 4つ?…

Discussion

ピンセット試料の調製における変更とトラブルシューティング

クローニングベクターの選択 。ここに記載した一般的スキーム（ 図3）は 、特別なクローニングベクターを必要としないが、ベクターは、プロモーターが所望の位置にPCRを介して導入することができるような転写を容易にするために固有のT7またはT3プロモーターを持た…

Materials

Minitweezers	Steven B. Smith Engineering		http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card	National Instruments	USB-6351
Video card	National Instruments	PCI-1407
Labview programming software	National Instruments
NI Vision Builder	National Instruments
Laser engraver	Epilogue laser systems	Zing-16
PCR purification kit	Qiagen	28104
MEGAscript T7 kit	Life Technologies	AM1334
MEGAclear kit	Life Technologies	AM1908
Biotin-11-UTP	Thermo Fisher	FERR0081
T4 DNA polymerase	New England Labs	M0203
Streptavidin coated microsphere	Spherotech	SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere	Spherotech	DIGP-20-2
Size standard microspheres	Spherotech	PPS-6K
Kapton tape	Kaptontape.com	KPPTDE-1
No. 2 cover glass	Thermo Fisher	12-543D