التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات
Summary
منارات ثنائي الجزيء Ratiometric (RBMBs) يمكن استخدامها لصورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية. هنا، نحن تصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم من RBMBs إلى الخلايا عن طريق microporation والتصوير الفلورسنت النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي.
Abstract
أدى إدراك متزايد أن كلا من التنظيم الزماني والمكاني في التعبير الجيني يمكن أن يكون لها عواقب مهمة على وظيفة الخلية إلى تطوير تقنيات مختلفة لتصور النصوص الفردية RNA في الخلايا الحية واحدة. أسلوب واحد الواعدة التي تمت مؤخرا وصفت تستخدم تحقيقا القائم على قليل النوكليوتيد البصرية، ratiometric منارة ثنائي الجزيء (RBMB)، للكشف عن النصوص RNA التي تم تصميمها لاحتواء أربعة على الأقل يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل الهدف RBMB في المنطقة 3'-غير مترجمة. صممت خصيصا لRBMBs تنبعث منها إشارة مشرق الفلورسنت على التهجين إلى RNA مكمل، لكن على خلاف ذلك تبقى مروي. استخدام مسبار الاصطناعية في هذا النهج يتيح صامد، أحمر تحول، والأصباغ العضوية انبعاثاتها للغاية لاستخدامها في التصوير. ربط RBMBs متعددة إلى RNA محاضر النتائج هندسيا في بقع منفصلة مضان عندما ينظر إليها تحت المجهر الفلورسنت واسعة المجال. وبالتالي، فإن حركة النصوص RNA الفردية يمكن تصور بسهولة في الوقت الحقيقي من خلال اتخاذ سلسلة زمنية من الصور الفلورسنت. نحن هنا وصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم في الخلايا عن طريق microporation والعيش خلية التصوير النصوص RNA واحدة.
Introduction
التعبير وتنظيم محاضر RNA هو عملية معقدة وديناميكية هي المسؤولة إلى حد كبير عن السيطرة على سلوك الخلية ومصير. على الرغم من أهمية RNA في فرض وظيفة الخلية كان معروفا لبعض الوقت، غالبا ما يكون من الصعب رسم وصلات واضحة بين الاثنين لأن معظم أدوات التحليل RNA تفتقر إلى القرار المكانية والزمانية اللازمة لالتقاط الأحداث التنظيمية الهامة مثل النسخ انفجار، RNA الاتجار، ومعالجة RNA محلية. وقد أدى ذلك إلى ظهور العديد من التقنيات التي تسمح النصوص RNA الفردية أن تصور في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي 1. ولعل أبرز هذه التقنيات تستخدم انصهار بروتين GFP-MS2 لاستهداف RNA التي تم تصميمها لاحتواء يكرر جنبا إلى جنب لموقع ملزمة MS2 في 3'-UTR 2،3. من خلال جلب جزيئات GFP متعددة في مقربة، تظهر النصوص RNA الفردية البقع الفلورسنت ومشرقعبر مضان المجهري. وقد وفرت نظام GFP-MS2 نظرة غير مسبوقة في السلوك RNA، بما في ذلك التصور المباشر وقياسات النسخي انفجار 4،5، كشف فريد التعريب شبه الخلوية والمعالجة 6-9، في الوقت الحقيقي والتصوير النقل RNA 10. ومع ذلك، على الرغم من الإمكانات الهائلة للنظام GFP-MS2، يمكن غير منضم GFP-MS2 البروتينات الانصهار إنشاء إشارة الفلورسنت الخلفية العالية التي تحد من التنوع والنطاق الديناميكي لهذه التقنية. وقد وضعت عدة طرق للحد من هذه الإشارة الخلفية، بما في ذلك التقسيم التحت خلوية من غير منضم GFP-MS2 10، البروتين جزء تكامل 11، وRNA ملزم البروتينات البديلة ويستهدف 12. ومع ذلك، كل هذه الأساليب لا تزال حساسة إلى التعبير النسبي والكلي للهدف RNA والبروتين GFP-MS2 الانصهار.
باعتبارها وlternative إلى أنظمة GFP-MS2، قد استخدمت أيضا منارات الجزيئية للكشف عن النصوص RNA هندسيا مع تكرار جنبا إلى جنب لموقع ملزم التكميلي في 3'-UTR 13،14. منارات الجزيئية هي تحقيقات قليل النوكليوتيد تشكيل دبوس الشعر التي وصفت في نهاية واحدة مع وفاكهه تقضي على الطرف الآخر مع مراسل الفلورسنت. عندما لا تكون ملزمة لاستهداف RNA مراسل الفلورسنت وفاكهه تقضي تبقى على مقربة، مما أدى إلى حالة منخفضة الفلورسنت. على التهجين، ويضطر مراسل الفلورسنت وفاكهه تقضي على حدة ويتم استعادة مضان. على غرار نظام GFP-MS2، ربط منارات الجزيئية متعددة على واحدة النتائج RNA نسخة في بقعة مضيئة الفلورسنت التي يمكن تحديدها بواسطة المجهر مضان. ومع ذلك، من المتوقع أن تكون أقل من ذلك بكثير، وذلك بسبب التكوين مروي من منارات الجزيئية غير منضم مضان الخلفية. للأسف، على الرغم من أن آلية تفعيل ذكية وهو مدرج في متصميم منارة olecular، هناك الآن أدلة متزايدة على أن الغير مهجنة منارات الجزيئية لا تبقى في التشكل عند منعطف حاد أدخلت الخلايا الحية. وبالتالي، فإنها تولد إشارة إيجابية كاذبة أن يخفف كثيرا للإشارة إلى الخلفية. للتغلب على هذا القصور، وضعنا مؤخرا تحقيقا اصطناعي جديد لتصوير RNA في الخلايا الحية، منارات ثنائي الجزيء ratiometric (RBMBs، الشكل 1A) 15،16. وتتكون من شقين RBMBs قليل النوكليوتيد 2'-O-الميثيل التي تشكل هيكل هجين مع ميزات من كلا دبوس الشعر القصير RNA (shRNA) ومنارات الجزيئية. آلية حلقة وتفعيل مضان مشابهة لمنارة الجزيئية، في حين أن نطاق طويل مزدوج تقطعت بهم السبل مع عبء 3'-UU هو أكثر سمة من shRNA. تم تصميم ميزات shRNA لدفع التصدير النووي الذي وجدنا زيادة عمر الخلايا إلى> 24 ساعة، مع الحد الأدنى من تحلل ملحوظ، ويمنع فتح غير محددة من الحلقة. ونتيجة لذلك RBMBs تظهر خلفية إشارة إلى أعلى بكثير من منارات الجزيئية.
تجدر الإشارة إلى أن RBMBs لا يمكن إعدادها باستخدام أليغنوكليوتيد] الحمض النووي، منذ تحقيقات المعتمدة على الحمض النووي لا تمتلك نفس القدرات التصديرية النووية تحقيقات القائم على الحمض النووي الريبي. هيكليا، تم تصميم حلقة RBMB عادة ما بين 15 و 21 قواعد طويلة، لخلق التوازن بين الخصوصية والانتقائية على RNA التهجين. تم تصميم جذع قصير الذي يشكل من نطاقات مكمل النفس اثنين عادة ما يكون 4 القواعد. إذا تم تحديد الجذعية أطول، فإن معدل التهجين بين حلقة RBMB وRNA الهدف هو تباطأ بشكل ملحوظ 17،18. على العكس، عندما يتم تحديد تسلسل الجذعية أقصر درجة حرارة انصهار غالبا ما تكون منخفضة جدا للحفاظ على الهيكل الجذعية حلقة عند 37 درجة مئوية، مما يؤدي إلى إشارة خلفية عالية. خصوصية RBMB هي أيضا حمراءuced كما هو تقصير طول الساق. منذ تسلسل RBMB الجذعية حلقة يمكن أيضا أن تؤثر على الأداء RBMB، فإنه يجب أن يتم اختيار بعناية 19. على وجه الخصوص، ينبغي أن يكون تسلسل حلقة مثالية الحد الأدنى من هيكل الثانوي، هجن لتسلسل RNA مع الحد الأدنى من هيكل الثانوي، وتجنب مواقع الربط البروتين، وتجنب خارج هدف ملزم. التوقعات كل RBMB وRNA هيكل الثانوي يمكن الحصول عليها باستخدام برنامج مثل mfold 20. يمكن تحديد التكميلية خارج المواقع المستهدفة باستخدام أداة بسيطة المحلية تعيين بحث النوكليوتيدات (انفجار). ومع ذلك، بسبب التضارب في توقعات النموذج وصعوبة في تحديد مواقع المتعهدة البروتين، ويجب في نهاية المطاف يمكن التحقق من صحة خصوصية كل RBMBs تجريبيا.
إذا المرغوب فيه، وهو صبغ إشارة غير مروي الذي هو غير حساس للدولة التهجين يمكن أن تضاف إلى RBMB 15. إضافة صبغة مرجعية يمكن للعلاقات العامةأوفيد علامة للتسليم التحقيق واستخدامها للتصوير ratiometric، إذا كانت هناك حاجة قياسات أكثر دقة من إجمالي مضان الخلوية. الأصباغ إشارة تسمح القياسات لتعديلها الاختلافات في الخلفية بسبب خلية الى خلية الاختلافات في التسليم. ومع ذلك، عندما التصوير RNA الفردية النصوص الصبغة المرجعية ليس ضروريا. والجدير بالذكر، أن بعض الأصباغ إشارة تتداخل مع تصدير RBMBs من النواة، مما أدى إلى إشارة الخلفية أعلى قليلا في النواة.
عندما تكون مصممة بشكل صحيح، RBMBs يمكن استخدامها لنسخ صورة RNA الفردية في الخلايا الحية واحدة، إذا تم تصميم الحمض النووي الريبي الهدف لاحتواء أربعة مواقع على الأقل RBMB ملزم (الشكل 1B) 16. RBMBs يمكن تقديمها بكفاءة إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا عبر microporation، مع قليل من دون التأثير على الخلايا الحيوية 21، والقياسات الكمية في التعبير الجيني يمكن أن تكونحصلت في غضون 30 دقيقة. وعلاوة على ذلك، فإن المنهجية هي حساسة نسبيا لمستويات تركيز RBMB وRNA الهدف، منذ مضان من RBMBs غير منضم تطفئ بكفاءة. هنا نقدم وصفا مفصلا للمنهجية المستخدمة في إعداد وتنقية RBMBs، فضلا عن إجراء عام لتقديم RBMBs في الخلايا الحية عبر microporation والتصوير النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على صورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية باستخدام المجهر واسعة المجال التقليدي تتطلب إشارة مشرقة وصامد الفلورية لتترافق مع كل نسخة RNA وخلفية منخفضة الفلورسنت المنبعثة من تحقيقات الفلورسنت غير منضم. في هذه الطريقة، يتم التوصل إلى إشارة الفلورسنت مشرق بوا?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جائزة مؤسسة العلوم الوطنية التوظيف (0953583) والمعهد الوطني للصحة NCI / R21-CA116102، NCI / R21-CA125088، NIBIB / R01-EB012065، NCI / R01-CA157766.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
Referenzen
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
