Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

Summary

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

Abstract

A crescente compreensão de que tanto a regulação temporal e espacial da expressão de genes pode ter consequências importantes para a função da célula levou ao desenvolvimento de diversas técnicas para visualizar os transcritos de ARN individuais em células vivas individuais. Uma técnica promissor que tem sido recentemente descrito utiliza uma sonda baseada no oligonucleótido óptico, raciométrica baliza bimolecular (RBMB), para detectar transcritos de ARN que foram modificados para conter, pelo menos, quatro repetições em tandem da sequência alvo RBMB na região 3 'não traduzida. RBMBs são especificamente concebidos para emitir um sinal fluorescente brilhante após hibridação com o ARN complementar, mas caso contrário, permanecer extinta. O uso de uma sonda sintética nesta abordagem permite fotoestável, vermelho-deslocado, e corantes orgânicos altamente emissiva para ser usado para imagiologia. A ligação de vários RBMBs para os transcritos de ARN modificadas resulta em manchas discretas de fluorescência quando visto sob um microscópio de fluorescência de campo amplo. Por conseguinte, o movimento de transcritos de ARN individuais podem ser facilmente visualizados em tempo real pelo tempo de tomar uma série de imagens fluorescentes. Aqui descreve-se a preparação e purificação de RBMBs, entrega em células de formação de microporos e vive-célula imagiologia de transcritos de ARN.

Introduction

A expressão e regulação dos transcritos de RNA é um processo complexo e dinâmico, que é em grande parte responsável por controlar o comportamento das células e destino. Embora a importância da RNA em função das células ditando tem sido conhecida há algum tempo, muitas vezes é difícil estabelecer ligações claras entre os dois desde que a maioria das ferramentas de análise de RNA não têm a resolução espacial e temporal exigido para capturar eventos regulatórios importantes, tais como a transcrição de ruptura, RNA tráfico e processamento de RNA localizada. Isto levou ao aparecimento de diversas técnicas que permitem que os transcritos de ARN individuais a serem visualizados em células vivas em tempo real ^1. Talvez o mais importante destas técnicas utiliza uma proteína de fusão GFP-MS2 de RNA alvo, que tenha sido modificado para conter repetições em série de local de ligação MS2 na 3'-UTR ^{de 2,3.} Ao trazer várias moléculas de GFP em estreita proximidade, transcrições de RNA individuais aparecem manchas fluorescentes como brilhantesatravés de microscopia de fluorescência. O sistema de GFP-MS2 forneceu uma visão sem precedentes sobre o comportamento do RNA, incluindo a visualização direta e medidas de transcrição estourando ^4,5, detecção de localização sub-celular exclusivo e processamento de ^6-9, e imagens em tempo real do transporte de RNA ^10. No entanto, apesar do enorme potencial de o sistema de GFP-MS2, proteínas de fusão GFP-MS2 não ligados podem criar um sinal de fluorescência de fundo elevado, que limita a versatilidade e gama dinâmica desta técnica. Várias abordagens foram desenvolvidas para limitar o sinal de fundo, incluindo compartimentalização subcelular de desacoplado GFP-MS2 ^10, fragmento de proteína complementação ^11, e proteínas de ligação de RNA alternativas e tem como alvo ^12. No entanto, todas estas abordagens permanecem sensíveis para a expressão relativa e total do alvo de ARN e proteína de fusão GFP-MS2.

Como umlternative para os sistemas de GFP-MS2, faróis moleculares também têm sido utilizados para detectar transcritos de ARN modificadas com repetições em tandem de o sítio de ligação complementar na 3'-UTR ^13,14. Os faróis moleculares são sondas oligonucleotídicas de formação de gancho que estão marcadas, numa extremidade com um extintor e na outra extremidade com um repórter fluorescente. Quando não está ligado ao RNA alvo do repórter fluorescente e extintor permanecem em estreita proximidade, resultando num estado de baixa fluorescência. Após a hibridação, o repórter fluorescente e extintor ser separadas e a fluorescência é restaurado. Semelhante ao sistema de GFP-MS2, a ligação de vários faróis moleculares para um único transcrito de ARN resulta em uma mancha fluorescente brilhante, que pode ser identificado por meio de microscopia de fluorescência; no entanto, a fluorescência de fundo deverá ser de muito menor, devido à configuração da extinta faróis moleculares não ligados. Infelizmente, apesar de o mecanismo de activação inteligente que é incorporada no mprojeto farol olecular, agora há evidências crescentes de que não hibridizada beacons moleculares não permanecem na conformação hairpin quando introduzido em células vivas. Por conseguinte, eles geram um sinal falso-positivo que reduz significativamente a relação sinal-fundo. Para superar essa deficiência, que recentemente desenvolveu uma nova sonda sintética para RNA de imagem em células vivas, balizas bimoleculares proporcional (RBMBs; Figura 1A) ^15,16. RBMBs são compostas de duas cadeias oligonucleotídicas 2'-O-metilo que forma uma estrutura híbrida com as características de ambos os ARN curto hairpin (shRNA) e faróis moleculares. O mecanismo de activação circular e de fluorescência é semelhante ao de farol molecular, enquanto que o domínio de cadeia dupla longo com uma saliência 3'-UU é mais característico dos shRNA. Os recursos shRNA são projetados para conduzir exportação nuclear, o que temos encontrado aumenta vida intracelular de> 24 horas, com a degradação observável mínimo, eimpede a abertura não específico do ciclo. Como um resultado RBMBs apresentam um fundo de sinal-para-significativamente mais elevada do que faróis moleculares.

Deve notar-se que RBMBs não pode ser preparado utilizando os oligonucleótidos de ADN, uma vez que sondas baseadas em ADN não possuem as mesmas capacidades de exportação nuclear como sondas baseados no RNA. Estruturalmente, o loop RBMB é tipicamente concebida para estar entre 15 e 21 bases de comprimento, para criar um equilíbrio entre a especificidade e selectividade mediante hibridação de ARN. O curta-tronco que se forma a partir dos dois domínios auto-complementares normalmente é projetado para ser de 4 bases. Se uma haste mais longa for selecionado, a taxa de hibridação entre o loop RBMB e RNA alvo fica lento significativamente ^17,18. Por outro lado, quando uma sequência de caule mais curto é seleccionada a temperatura de fusão é frequentemente demasiado baixa para manter a estrutura em ansa pedunculada, a 37 ° C, conduzindo a um sinal de fundo elevado. A especificidade do RBMB também é vermelhouced como o comprimento da haste é encurtado. Como a seqüência do RBMB tronco de loop também pode influenciar o desempenho RBMB, deve ser cuidadosamente selecionados ^19. Em particular, as sequências de loop ideal deve ter o mínimo de estrutura secundária, hibridizam com seqüências de RNA com estrutura secundária mínima, evitar locais de ligação de proteínas e evite off-meta vinculativa. Previsões de ambos RBMB e estrutura secundária do RNA pode ser obtida usando softwares como o mfold ^20. Complementares locais fora do alvo podem ser identificados através de um trabalho de busca local ferramenta básica de nucleotídeos (BLAST). No entanto, por causa de inconsistências nas previsões do modelo e da dificuldade em identificar sites de licitação de proteínas, a especificidade de todos os RBMBs deve finalmente ser validadas experimentalmente.

Se desejável, um corante de referência unquenched que é insensível ao estado de hibridação pode ser adicionado à RBMB ^15. A adição de um corante de referência pode prOvide um marcador para entrega sonda e ser usado para geração de imagens ratiometric, se forem necessárias medições mais precisas de fluorescência celular total. Os corantes de referência permite a medição de ser ajustados para as diferenças no fundo, devido às variações de célula-a-célula no parto. No entanto, na obtenção de imagens de ARN transcritos indivíduo o corante de referência não é necessário. Notavelmente, alguns corantes de referência pode interferir com a exportação de RBMBs a partir do núcleo, conduzindo a um sinal de fundo ligeiramente mais elevada no núcleo.

Quando concebida adequadamente, RBMBs pode ser utilizado para imagem transcritos de ARN individuais em células vivas individuais, se o RNA alvo é modificado para conter, pelo menos, quatro locais de ligação RBMB (Figura 1B) ^16. RBMBs pode ser eficientemente entregues em uma ampla gama de tipos de células, através de formação de microporos, com pouco ou nenhum efeito sobre a viabilidade das células ^21, e as medições quantitativas da expressão do gene pode seradquirido dentro de 30 min. Além disso, a metodologia é relativamente insensível a níveis de concentração RBMB e RNA alvo, uma vez que a fluorescência a partir de RBMBs não ligadas é extinta eficientemente. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada da metodologia utilizada para preparar e purificar RBMBs, bem como um procedimento geral para a entrega de RBMBs em células vivas através de microporos ea imagem de transcrições de RNA em tempo real.

Protocol

Neste protocolo, um oligonucleotídeo (RBMB1) foi marcado em sua extremidade 5 'com um corante repórter CF640R e tem a sequência: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3'. Domínios auto-complementares, que levam à formação da estrutura em grampo, estão em negrito. O segundo oligonucleótido (RBMB2) foi marcado na extremidade 3 'com um agente de extinção de Iowa Preto RQ-Sp e tem a sequên…

Representative Results

Pouco tempo após a formação de microporos de células HT1080 na presença de RBMBs, os transcritos de ARN individuais que foram modificados para conter vários locais de ligação RBMB no seu 3'-UTR aparecem como manchas fluorescentes brilhantes quando visualizados por microscopia de fluorescência de todo o campo (Figura 2). Enquanto transcrições de RNA individuais com sítios de ligação de apenas quatro RBMB podem ser visualizados em células vivas, mais sites na 3'-UTR obrigatório RBM…

Discussion

A capacidade de imagens simples transcritos de ARN modificadas em células vivas utilizando um microscópio de campo amplo convencional requer um sinal fluorescente brilhante e fotoestáveis ​​para ser associado com cada transcrição de ARN e um fundo de fluorescência que emana de baixo sondas fluorescentes não ligados. Neste método, um sinal fluorescente brilhante é conseguida por hibridação múltipla (até 96) à base de sondas fluorescentes de oligonucleótidos, ou seja RBMBs, para cada transcriç…

Materials

Nuclease-free Water	Life Technologies	AM9932	no DEPC-treated
DPBS	Life Technologies	14190-144	No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	P290-500
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P284-500
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	S381-500
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5mL
Chromatography Column	Kimble Chase Life Science	420400-0720	0.7x20cm
Superdex 75 Prep Grade	GE healthcare	17-1044-01
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS-300
Syringe	BD	301035	60mL, Luer-lok tip
Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC501096	Mw 10,000 cutoff
Centrifuge 5418	Eppendorf
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG	lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass	Fisher Scientific	155409	Working volume 0.2-0.5mL
HT1080	ATCC	CCL-121	Human Fibrosarcoma cell line
Cell Culture Flask	Corning	430639	25cm2
DMEM	Life Technologies	11965084	High glucose
DMEM without Phenol Red	Life Technologies	21063029	High glucose
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
Penecillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122
Trypsin	Life Technologies	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system	Life Technologies	MPK5000
Neon transfection system kit	Life Technologies	MPK1096
Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-10
Hoescht 33342	Life Technologies	H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus
SOLA light engine	Lumencor
Metamorph	Molecular Devices		Software controlling microscope
Immersol oil 518F	Fisher Scientific	12-624-66B