Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons
Summary
Ratiometrische bimoleculaire bakens (RBMBs) kan worden gebruikt om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding en zuivering van RBMBs, levering van RBMBs in cellen van microporatie en fluorescentie beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.
Abstract
De toenemende besef dat zowel de temporele en ruimtelijke regulatie van genexpressie kan belangrijke gevolgen cel functie heeft geleid tot de ontwikkeling van diverse technieken om afzonderlijke RNA transcripten in enkele levende cellen te visualiseren. Een veelbelovende techniek die onlangs is beschreven maakt gebruik van een oligonucleotide-gebaseerde optische sonde, ratiometrische bimoleculaire baken (RBMB), RNA transcripten die zijn ontworpen om ten minste vier tandem repeats van de RBMB doelsequentie bevatten het 3'-ongetranslateerde gebied te detecteren. RBMBs zijn speciaal ontworpen om een fel fluorescerend signaal na hybridisatie met complementaire RNA uit te zenden, maar anders blijven uitgeblust. Het gebruik van een synthetische probe in deze aanpak fotostabiele, rood-verschoven en hoog emissieve organische kleurstoffen worden gebruikt voor beeldvorming. Binding van meerdere RBMBs de gemanipuleerde RNA transcripten resultaten in discrete fluorescentie spots wanneer bekeken onder een breed veld fluorescentiemicroscoop. Dientengevolge kan de beweging van de individuele RNA-transcripten gemakkelijk worden gevisualiseerd in real-time door middel van een tijdreeks van fluorescentiebeelden. Hier beschrijven we de voorbereiding en de zuivering van RBMBs, levering in cellen door microporatie en live-cell imaging van enkelvoudige RNA-transcripten.
Introduction
De expressie en regulatie van RNA transcripten is een complex en dynamisch proces dat grotendeels verantwoordelijk voor de controle cel gedrag en het lot. Hoewel het belang van RNA in dicteren celfunctie is enige tijd bekend, is het vaak moeilijk om duidelijke verbindingen te maken tussen de twee aangezien de meeste RNA analysemiddelen missen de ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk belangrijke regulerende gebeurtenissen zoals transcriptie barsten vangen, RNA mensenhandel, en gelokaliseerde RNA processing. Dit heeft geleid tot de komst van verschillende technieken waarmee individuele RNA-transcripten worden gevisualiseerd in levende cellen in real-time 1. Misschien de meest prominente van deze technieken maakt gebruik van een GFP-fusie-eiwit MS2 RNA dat is ontworpen om tandem repeats van het MS2-bindingsplaats bevatten in de 3'-UTR 2,3 doel. Doordat meerdere GFP moleculen in de nabijheid, individuele RNA-transcripten lijken zo helder fluorescerende vlekkenvia fluorescentiemicroscopie. De GFP-MS2 systeem ongekend inzicht in RNA gedrag, waaronder directe visualisatie en metingen van transcriptionele barsten 4,5 detectie van unieke subcellulaire lokalisatie en verwerking 6-9 en real-time imaging van RNA transport 10 ontvangen. Ondanks het enorme potentieel van het GFP-MS2 systeem ongebonden GFP-MS2 fusie-eiwitten kunnen een hoog achtergrondniveau fluorescentiesignaal dat de veelzijdigheid en dynamisch bereik van deze techniek beperkt creëren. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om dit achtergrondsignaal beperken, waaronder subcellulaire compartimentalisatie van ongebonden GFP-MS2 10, eiwit fragment complementatie 11 en alternatieve RNA bindende eiwitten en richt 12. Echter, al deze benaderingen gevoelig voor de relatieve en de totale expressie van het RNA-doel en GFP-MS2 fusieproteïne blijven.
Als eenALTERNATIEVE de GFP-MS2 systemen, hebben moleculaire beacons ook gebruikt om gemodificeerde RNA transcripten met tandem repeats van de complementaire bindingsplaats in het 3'-UTR 13,14. Molecular beacons worden hairpin vormende oligonucleotide probes die gelabeld zijn aan een uiteinde met een quencher en aan het andere uiteinde met een fluorescerende reporter. Wanneer niet gebonden aan de doel-RNA fluorescente reporter en quencher blijven nabijheid, waardoor een laag fluorescerende toestand. Na hybridisatie worden de fluorescerende reporter en quencher elkaar gedwongen en fluorescentie wordt hersteld. Vergelijkbaar met de GFP-MS2 systeem, de binding van meerdere moleculaire beacons op een RNA transcript leidt tot een heldere fluorescerende vlek die kunnen worden geïdentificeerd door fluorescentie microscopie; echter de achtergrond fluorescentie verwachting veel lager vanwege het afgeschrikte configuratie van ongebonden molecular beacons. Helaas, ondanks de slimme activeringsmechanisme dat wordt opgenomen in de molecular baken ontwerp, is er nu steeds meer aanwijzingen dat de moleculaire bakens ongehybridiseerde doen in de hairpin conformatie niet blijven voor het binnenbrengen in levende cellen. Dientengevolge genereren ze een vals-positief signaal dat de signaal-achtergrond aanzienlijk vermindert. Om deze tekortkoming te ondervangen, hebben we onlangs een nieuwe synthetische probe voor beeldvorming RNA in levende cellen, ratiometrisch bimolecular bakens (RBMBs Figuur 1A) 15,16. RBMBs bestaan uit twee 2'-O-methyl oligonucleotide strengen die een hybride structuur met kenmerken van zowel korte hairpin RNA (shRNA) en moleculaire bakens vormen. De lus en fluorescentie activeringsmechanisme is vergelijkbaar met de moleculaire beacon, terwijl de lange dubbelstrengs domein met een 3'-overhang UU is kenmerkend shRNA. De shRNA functies zijn ontworpen om nucleaire export, die we stijgingen zijn gevonden intracellulair leven naar> 24 uur, met een minimale waarneembare degradatie te rijden, envoorkomt niet-specifieke opening van de lus. Hierdoor RBMBs vertonen een significant hoger signaal-achtergrond dan moleculaire beacons.
Opgemerkt zij dat RBMBs niet kunnen worden bereid met DNA oligonucleotiden, aangezien DNA-probes hebben dezelfde mogelijkheden als nucleaire export-RNA probes bezitten. Structureel wordt de RBMB loop meestal ontworpen om tussen de 15 en 21 basen lang, om een evenwicht te vinden tussen specificiteit en selectiviteit op RNA hybridisatie te creëren. De korte steel die zich vormt uit de twee zelf-complementaire domeinen gewoonlijk ontworpen om 4 basen. Als er een langere steel is geselecteerd, wordt de snelheid van hybridisatie tussen de RBMB lus en target RNA aanzienlijk vertraagd 17,18. Wanneer daarentegen een kortere steel sequentie wordt geselecteerd de smelttemperatuur vaak te laag om de stam-lusstructuur handhaven bij 37 ° C, waardoor een hoog achtergrondsignaal. De specificiteit van de RBMB is ook roodptie als de steellengte wordt verkort. Aangezien de sequentie van de RBMB stamlus kan RBMB prestaties beïnvloeden, moet zorgvuldig worden geselecteerd 19. Met name moet ideaal lussequenties minimale secundaire structuur, hybridiseren met RNA-sequenties met minimale secundaire structuur, voorkomen eiwitbindingsplaatsen en vermijd off-target binding. Voorspellingen van zowel RBMB en RNA secundaire structuur kan worden verkregen met behulp van software zoals mfold 20. Complementaire off-target sites kunnen geïdentificeerd met behulp van een nucleotide Basic Local Opdracht Search Tool (BLAST). Echter, als gevolg van inconsistenties in de modelvoorspellingen en de moeilijkheid bij het identificeren van eiwit afwachtend sites, de specificiteit van alle RBMBs uiteindelijk moet worden experimenteel gevalideerd.
Indien gewenst kan een afgeschrikte referentie kleurstof die ongevoelig is voor de hybridisatie toestand worden toegevoegd aan de RBMB 15. De toevoeging van een verwijzing kleurstof kan prOvide een marker voor levering probe en zijn gebruikt voor ratiometrische beeldvorming, indien meer nauwkeurige metingen van de totale cellulaire fluorescentie vereist. De referentie kleurstoffen maakt metingen worden gecorrigeerd voor verschillen in de achtergrond wegens cel-cel variaties in de aflevering. Wanneer beeldvorming individuele RNA transcripten de referentie kleurstof is niet noodzakelijk. Met name kan een verwijzing kleurstoffen interfereren met de uitvoer van RBMBs van de kern leidt tot een iets hogere achtergrondsignaal in de kern.
Wanneer goed ontworpen, kan RBMBs worden gebruikt om het individuele RNA-transcripten in enkele levende cellen, als het doel RNA is ontworpen om ten minste vier RBMB bindingsplaatsen (Figuur 1B) 16 bevatten. RBMBs kan efficiënt afgeleverd in diverse celtypen via microporatie, met weinig tot geen effect op de levensvatbaarheid van de cellen 21 en kwantitatieve metingen van genexpressie kanverworven binnen de 30 minuten. Bovendien is de methodiek is vrij ongevoelig voor RBMB concentratie en doelwit RNA spiegels, sinds fluorescentie van ongebonden RBMBs efficiënt wordt uitgeblust. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de gebruikte bereiden en zuiveren RBMBs methodologie en een algemene methode voor de levering van RBMBs in levende cellen via microporatie en de beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mogelijkheid om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen met een gebruikelijke wide-field microscoop vereist een heldere en fotostabiele fluorescentiesignaal te worden bij elke RNA transcript en een lage achtergrond fluorescentie afkomstig van ongebonden fluorescentie probes. In deze werkwijze wordt een helder fluorescerend signaal bereikt hybridiseren meervoudige (tot 96) oligonucleotide-gebaseerde fluorescente probes, dwz RBMBs, op elk RNA-transcript. Aangezien weinig als vier bindings…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation LOOPBAAN Award (0953583) en het National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
Referenzen
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
