In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons
Summary
Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l'imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale.
Abstract
La crescente consapevolezza che sia la regolazione temporale e spaziale dell'espressione genica può avere conseguenze importanti sulla funzione cellulare ha portato allo sviluppo di tecniche diverse per visualizzare i singoli trascritti di RNA in cellule viventi singoli. Una tecnica promettente che è stato recentemente descritto utilizza una sonda basata oligonucleotide-ottica, raziometrico faro biomolecolare (RBMB), per rilevare trascritti di RNA che sono stati progettati per contenere almeno quattro ripetizioni in tandem della sequenza bersaglio RBMB nella regione 3'-non tradotta. RBMBs sono specificamente progettati per emettere un segnale fluorescente su ibridazione di RNA complementare, ma per il resto rimangono spente. L'uso di una sonda sintetica in questo approccio consente fotostabile, rossa spostata, e coloranti organici altamente emissive da utilizzare per l'imaging. Il legame di più RBMBs ai ingegnerizzati RNA trascrizioni risultati in macchie di fluorescenza discreti se visto sotto un microscopio a fluorescenza a livello di campo. Di conseguenza, il movimento dei singoli trascritti di RNA può essere facilmente visualizzato in tempo reale prendendo una serie temporale di immagini fluorescenti. Qui si descrive la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna in cellule da microporation e live-cell imaging trascrizioni singoli di RNA.
Introduction
L'espressione e la regolazione dei trascritti di RNA è un processo complesso e dinamico che è in gran parte responsabile del controllo del comportamento delle cellule e del destino. Anche se l'importanza di RNA in funzione delle cellule dettare è noto da qualche tempo, è spesso difficile tracciare chiare connessioni tra le due, in quanto la maggior parte degli strumenti di analisi di RNA non hanno la risoluzione spaziale e temporale necessaria per acquisire importanti eventi normativi quali la trascrizione scoppio, RNA traffico, e l'elaborazione di RNA localizzata. Questo ha portato l'avvento di diverse tecniche che consentono singoli trascritti di RNA per essere visualizzati in cellule viventi in tempo reale 1. Forse, il più importante di queste tecniche utilizza una proteina di fusione GFP-MS2 di RNA che è stato progettato per contenere ripetizioni in tandem del sito di legame MS2 nel 3'-UTR 2,3 bersaglio. Portando più molecole di GFP in stretta vicinanza, le singole trascritti di RNA appaiono macchie fluorescenti luminositramite microscopia a fluorescenza. Il sistema di GFP-MS2 ha fornito una visibilità senza precedenti sul comportamento RNA, inclusi visualizzazione diretta e misure di trascrizione scoppio 4,5, il rilevamento di localizzazione sub-cellulare unico e lavorazione 6-9, e in tempo reale l'imaging del trasporto dell'RNA 10. Tuttavia, nonostante l'enorme potenziale del sistema GFP-MS2, proteine di fusione GFP-MS2 non legate possono creare un segnale di alta sfondo fluorescente che limita la versatilità e la gamma dinamica di questa tecnica. Diversi approcci sono stati sviluppati per limitare questo segnale di fondo, tra cui compartimentazione subcellulare di non legato GFP-MS2 10, proteina frammento complementazione 11, e proteine leganti RNA alternativi e obiettivi 12. Tuttavia, tutti questi approcci rimangono sensibili alla espressione relativa e totale del bersaglio RNA e proteina di fusione GFP-MS2.
Come unlternative ai sistemi GFP-MS2, fari molecolari sono stati utilizzati anche per rilevare trascritti di RNA ingegnerizzati con ripetizioni in tandem del sito di legame complementare nel 3'-UTR 13,14. Beacon molecolari sono sonde oligonucleotidiche-hairpin formando contrassegnate ad una estremità con un quencher e all'altra estremità con un reporter fluorescente. Quando non è vincolata a bersaglio RNA reporter fluorescente e quencher rimanere nelle immediate vicinanze, con un conseguente stato di bassa fluorescente. Dopo l'ibridazione, il reporter fluorescente e quencher sono costrette a parte e fluorescenza viene ripristinato. Simile al sistema GFP-MS2, il legame di molteplici fari molecolari su un singolo risultato di RNA trascritto in un punto luminoso fluorescente che può essere identificato mediante microscopia a fluorescenza; tuttavia, la fluorescenza di fondo dovrebbe essere molto inferiore, a causa della configurazione spento di fari molecolari legati. Sfortunatamente, nonostante il meccanismo di attivazione intelligente che è integrata mdisegno faro olecular, ora vi è una crescente evidenza che non ibridizzate fari molecolari non rimangono nella conformazione tornante quando introdotto in cellule viventi. Di conseguenza, generano un segnale falso-positivo che riduce significativamente il rapporto segnale-bassa. Per ovviare a questo inconveniente, abbiamo recentemente sviluppato una nuova sonda sintetica per l'imaging RNA nelle cellule viventi, raziometriche fari bimolecolari (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs sono composti da due filamenti di oligonucleotidi 2'-O-metil che formano una struttura ibrida con le caratteristiche di entrambe breve hairpin RNA (shRNA) e fari molecolari. Il meccanismo di loop e l'attivazione di fluorescenza è simile al segnale molecolare, mentre il lungo dominio a doppio filamento con una sporgenza 3'-UU è più caratteristico di shRNA. Le caratteristiche shRNA sono progettate per guidare l'esportazione nucleare, che abbiamo trovato aumenti di vita intracellulare per> 24 ore, con il minimo degrado osservabile, eimpedisce non specifico apertura del loop. Come risultato RBMBs presentano uno sfondo segnale-significativamente superiore beacon molecolari.
Va notato che RBMBs non possono essere preparati utilizzando oligonucleotidi di DNA, dal momento che le sonde basate sul DNA non possiedono le stesse capacità di esportazione nucleare come sonde di RNA. Strutturalmente, il ciclo RBMB è in genere progettato per essere tra 15 e 21 basi lungo, per creare un equilibrio tra specificità e selettività su RNA ibridazione. Il gambo corto che si forma dai due domini di auto-complementare di solito è progettato per essere 4 basi. Se si seleziona uno stelo più lungo, il tasso di ibridazione tra loop RBMB e RNA bersaglio è rallentato in modo significativo 17,18. Viceversa, quando è selezionata una sequenza più corta radice la temperatura di fusione è spesso troppo bassa per sostenere la struttura stem-loop a 37 ° C, portando ad un elevato segnale di fondo. La specificità del RBMB è anche rossouced come la lunghezza dello stelo si accorcia. Poiché la sequenza del RBMB stem-loop possono anche influenzare le prestazioni RBMB, deve essere attentamente selezionati 19. In particolare, le sequenze di loop ideale dovrebbe avere il minimo struttura secondaria, ibridare a sequenze di RNA con una minima struttura secondaria, evitare siti di legame della proteina, ed evitare fuori-obiettivo vincolante. Le previsioni di entrambi RBMB e struttura secondaria dell'RNA possono essere ottenuti utilizzando software come mfold 20. Complementari siti off-target possono identificato utilizzando un nucleotide base locale Assegnazione Search Tool (BLAST). Tuttavia, a causa delle incongruenze nei previsioni del modello e la difficoltà di identificare i siti di proteine di aspettare, la specificità di tutte le RBMBs deve infine essere convalidato sperimentalmente.
Se auspicabile, un colorante di riferimento unquenched insensibile allo stato ibridazione può essere aggiunto al RBMB 15. L'aggiunta di un colorante di riferimento può prOvide un marcatore per la consegna della sonda e possono essere usate per l'imaging raziometrico, se sono necessarie misure più accurate di fluorescenza cellulare totale. I coloranti di riferimento permette misurazioni da regolare per le differenze di fondo a causa di cell-to-cell variazioni nella consegna. Tuttavia, quando l'imaging RNA individuo trascrizioni il colorante di riferimento non è necessaria. In particolare, alcuni coloranti di riferimento possono interferire con l'esportazione di RBMBs dal nucleo, portando ad un segnale di fondo leggermente superiore nel nucleo.
Se progettato correttamente, RBMBs possono essere usati per immagine trascritti di RNA in cellule viventi individuo singolo, se l'RNA bersaglio è progettato per contenere almeno quattro siti di legame RBMB (Figura 1B) 16. RBMBs possono essere efficacemente forniti in una vasta gamma di tipi di cellule via microporation, con poco o nessun effetto sulla vitalità cellulare 21, e le misure quantitative di espressione genica possono essereacquisito entro 30 min. Inoltre, la metodologia è abbastanza insensibile a livelli di concentrazione RBMB e RNA bersaglio, dal momento che la fluorescenza da RBMBs non legato viene efficacemente spegne. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per preparare e purificare RBMBs, nonché una procedura generale per la fornitura di RBMBs in cellule vive tramite microporation e l'imaging di trascritti di RNA singoli in tempo reale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi utilizzando un microscopio a grande campo convenzionale richiede un segnale luminoso e fotostabile fluorescente per essere associate a ogni trascrizione di RNA e di uno sfondo fluorescente a basso proveniente da sonde fluorescenti non legati. In questo metodo, un segnale fluorescente è ottenuto ibridando multipla (fino a 96) sonde fluorescenti basato oligonucleotidi, cioè RBMBs, su ciascun trascritto di RNA. Tuttavia, solo qu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Science Foundation CARRIERA Award (0953583) e l'Istituto Nazionale di Salute NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
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