العمل مع الأنسجة البشرية لبالحركة أبحاث السرطان
Summary
Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.
Abstract
Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.
Introduction
وقد استفادت البحوث الطبية كثيرا من دراسة كل من خطوط الخلايا البشرية والنماذج الحيوانية. خطوط الخلايا تسمح لتحسين السيطرة على عناصر في النظام، وكذلك استخدام الخلايا من الكائن الحي السليم. العمل مع الخلايا البشرية، في حين أن أكثر تمثيلا، ويعرض لقطة مبسطة بشكل كبير من الآليات التي قد تكون مسؤولة عن الصحة والمرض، وذلك لأن خطوط الخلايا قد لا ألخص تأثير الخلايا الأخرى، مكونات اللحمية، والأجهزة التي قد تؤثر على ردود 1. من ناحية أخرى، النماذج الحيوانية، وإن لم يكن دقيقا تماما في استنساخ الأمراض التي تصيب البشر وعدم التجانس الوراثي، وتقديم مزيد من التبصر من خلال السماح لإدخال نظم الحيوانية كلها في معظم النماذج 2،3.
أوجه القصور جانبا، سواء الطرق لها فوائدها ومتكاملان. ومع ذلك، يبقى الهدف الرئيسي لدراسة الخلايا البشرية والأجهزة، في كامل الجسم، ونظام متعدد الجهاز. وفقا لذلك، والبحوث متعدية ديه تاكأون خطوات كبيرة في تسهيل دراسة بالأعضاء والأنسجة البشرية المستخرجة من المرضى، من أجل فهم أفضل للآليات المرض الأساسي. يقدم البحوث متعدية الاستفادة من دراسة نتيجة العلاجات والأمراض في الجسم بأكمله و في الخلايا المناسبة، وبالتالي توفير أفضل ما في العالمين بين الخلية والحيوان العمل 4.
الأبحاث المترجمة هو أيضا لا يخلو من العيوب. العينات المأخوذة من المرضى من البشر، على إزالة من المضيف، تخضع مباشرة لنقص التروية وغيرها من العوامل الخارجية التي من شأنها أن تكون محمية خلاف ذلك. هذا قد يؤدي إلى التغيرات الجزيئية والجينية الناجمة عن الإجهاد، ويسبب التحيز في دراسات لاحقة. ولذلك، فقد تم وضع الكثير من الجهد في استخراج ومعالجة الأنسجة من خلال وسائل صارمة للحفاظ على أفضل جهاز وسلامة الخلية للدراسات المصب 5. الأهم من ذلك، يجب أن يتم النظر في الطلبات المستقبلية بشكل وثيق عند اختيار أساليب سو تجهيز العينات البشرية، وأساليب معينة قد يكون ضارا المكونات الخلوية ومسارات إشارات في حين أن يجنب الآخرين.
لأي البحوث التي تنطوي على الأنسجة البشرية، يجب أن تعالج القضايا التنظيمية. بعد تقارير توسكيجي وبلمونت، كان هناك قبول متزايد لحقيقة أن ارتبط البحوث الطبية الحيوية مع المخاطر الكامنة يؤدي إلى المعضلات الأخلاقية التي لا مفر منها 6 في كثير من الأحيان. وقد أقر بالحاجة إلى معايير وطنية وإنشاء الحكومة الاتحادية مجالس المراجعة المؤسسية (IRBs) كوسيلة لدعم مبادئ تقرير بلمونت (احترام الأشخاص والاحسان والعدل).
IRB أي مؤسسة هو لجنة من الأطباء والباحثين وأعضاء المجتمع الذين يتحملون المسؤولية عن حماية المشاركين البحوث. ويتطلب ذلك أن الموافقة الطوعية الحصول عليها من جميع المشاركين في الدراسات والأبحاث الطبية، وأن يتم توثيق هذه الموافقة في الموافقة المسبقة FO جمهورية مقدونيا. وتهدف عملية الموافقة عن علم على توفير المعلومات الكافية لأحد المشاركين، بحيث يجوز قرار مستنير بشأن ما إذا كان أو لم يكن على الانخراط في دراسة، أو لمواصلة المشاركة. وفي هذا الصدد، يجب أن يكون وثيقة الموافقة المسبقة عن قراءة جيدة ويجب أن تكون مكتوبة في اللغة التي يمكن فهمها بسهولة (6 عشر إلى 8 مستوى القراءة الصف) على عدد السكان المستهدفين. يجب التقليل من احتمال الإكراه أو نفوذ لا مبرر له، ويجب أن يعطى موضوع متسع من الوقت للنظر في المشاركة. يجب أيضا أن يسمح للمشارك أن ممارسة حقهم في سحب الموافقة في أي مرحلة أثناء الدراسة دون عقوبة. الموافقة المستنيرة الطوعية هي شرط مسبق إلزامي للمشاركة موضوعا في مجال البحوث وكما أنها فعالة من الناحية القانونية 7.
وفقا للوائح لحماية حقوق الإنسان يخضع 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8)، ويجب إبلاغ المشاركين في الدراسة من غرض البحث والإجراءات يشارك في البحث، والبدائل في المشاركة، جميع المخاطر المتوقعة والمضايقات (بما في ذلك الضرر ليس فقط المادية ولكن أيضا الضرر النفسي والاجتماعي، أو الاقتصادي المحتمل، وعدم الراحة، أو إزعاج)، فوائد البحوث في المجتمع وربما للفرد، وطول الوقت ومن المتوقع أن يشارك في الموضوع، شخص الاتصال للحصول على إجابات على الأسئلة أو في حال وقوع الإصابات المرتبطة البحوث أو في حالات الطوارئ، البيان مشيرا إلى أن المشاركة طوعية، وسوف أن رفضها المشاركة لم تسفر عن أي نتائج أو أي خسارة من الفوائد مثل حلا وسطا في مجال الرعاية السريرية العادية أن المشاركين يحق لهم الحصول على نتيجة له / لها التشخيص، وأخيرا بيانا بشأن حق هذا الموضوع في السرية والحق في الانسحاب منالدراسة في أي وقت دون أي عواقب. لا ينبغي أن راهن عينات الأنسجة من المشاركين الذين سحب الموافقة أثناء الدراسة وجوب استنفاد فورا. التنازل عن واحد أو أكثر من عناصر الموافقة المسبقة يمكن الحصول عليها من IRB لبعض المشاريع البحثية التي لا يمكن عمليا أن يتم دون تغيير في العناصر المطلوبة أو للدراسات حيث العناصر المطلوبة غير قابلة للتطبيق. يجب توخي الحذر الشديد لضمان سرية البيانات. نقل التأمين الصحي وقانون محاسبة (HIPAA) هو القانون الاتحادي الذي يمنع استخدام أو الكشف عن "حماية المعلومات الصحية" (PHI) بدون موافقة كتابية من المشاركين. يشمل PHI لكن لا يقتصر على المعلومات الصحية المرسلة أو الاحتفاظ بها في أي شكل أو متوسطة، وتشمل المجالات التي يمكن أن تستخدم لتحديد هوية الأفراد 9.
من خلال هذا العمل، ونحن نهدف إلى الخطوط العريضة للبروتوكول التي يجب اتباعها خلال TISSUتجهيز ه – بما في ذلك المشتريات، والتخزين، والتأكيد على أهمية اتباع هذه المبادئ التوجيهية الصارمة وذلك للحد من التحيز التي قد تنجم بسبب ضغوط تتعرض الأنسجة لبناء الاستخراج. ونحن نسعى أيضا إلى تقديم لمحة موجزة عن فحوصات أو تحاليل (الشكل 1) التي يمكن أن يؤديها على هذه العينات المصب ذلك أن القراء قد جعل الحكم المؤهلين على ما مقايسة (ق) يناسب احتياجاتهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
في نهاية المطاف، ويجب أن تكون طرق المعالجة من قبل فرضية المطلوب والمتوقع المقايسات الفنية التي يتعين القيام بها (الشكل 1). يقدم القسم التالي لمحة عامة لوصف المقايسات المحتملة التي يمكن القيام بها في مثل هذه المقاطع الأنسجة. فمن بأي حال من الأحوال وجهة نظر شام…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل التبرعات الخيرية من جون جي ومؤسسة ماري ستيلا كينيدي التذكاري (المنحة # 0727033) والتحالف أبحاث سرطان الجلد. الكتاب أود أن أشكر جامعة الأنسجة تكساس MD اندرسون مركز سرطان المؤسسي البنك (ITB) لتنسيق توزيع الأنسجة وجمع وتسهيل الأبحاث المترجمة، وكذلك الدكتور اجناسيو Wistuba، الدكتور فيكتور برييتو، وإدارة مركز إم دي أندرسون للسرطان من علم الأمراض وبرنامج أطلق عليه الرصاص الميلانوما القمر. وأخيرا، والكتاب نود أن ننوه جميع المرضى والأسر المتضررة من سرطان الجلد.
Materials
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
Referenzen
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , (2010).
- McCabe, P. M., et al. Animal models of disease. Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M., Gilbert, N. The ethics of social research. Researching social life. , 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. . IRB guidebook. , (1993).
- . . MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, (2009).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -. Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemie. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nat Genet. 32, 526-532 (2002).
