Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research
Summary
Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.
Abstract
Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.
Introduction
A investigação médica tem beneficiado imensamente com o estudo de ambas as linhas de células humanas e modelos animais. As linhas celulares que permitam um melhor controlo dos componentes de um sistema, bem como a utilização de células a partir do próprio organismo. Trabalhando com células humanas, enquanto mais representativo, apresenta um instantâneo simplificado drasticamente de mecanismos que podem ser responsáveis pela saúde e doença, porque as linhas celulares podem não recapitular o impacto de outras células do estroma, componentes e órgãos que podem afectar as respostas 1. Por outro lado, os modelos animais, embora não totalmente precisos em reproduzir a doença humana e heterogeneidade genética, oferecem mais pistas, permitindo a entrada de sistemas de animais completos, na maioria dos modelos de 2,3.
Deficiências à parte, ambos os métodos têm suas vantagens e são complementares. No entanto, o principal objectivo continua a estudar células humanas e de órgãos, em uma de corpo inteiro, sistema de múltiplos órgãos. Assim, a investigação translacional tem taken grandes passos no sentido de facilitar o estudo de órgãos e tecidos humanos extraídos de pacientes, a fim de compreender melhor os mecanismos da doença subjacente. Investigação translacional oferece a vantagem de se estudar o resultado de tratamentos de doenças e em todo o corpo e em células apropriadas, assim fornecendo o melhor dos dois mundos entre células e animais de trabalho 4.
Investigação translacional também não é sem falhas. Amostras colhidas de pacientes humanos, após a remoção do hospedeiro, são imediatamente submetidos a isquemia e outros fatores externos a partir do qual eles seriam de outra forma protegidas. Isso pode resultar em alterações moleculares e genéticas induzidas pelo estresse, e causar viés nos estudos subsequentes. Portanto, muito esforço foi colocado em extração e processamento de tecidos através de métodos rigorosos para melhor preservar a integridade de órgãos e células para estudos jusante 5. É importante ressaltar que futuras aplicações devem ser consideradas estreitamente ao selecionar métodos ouf processamento de amostras humanas, como certos métodos podem ser prejudiciais aos componentes celulares e vias de sinalização enquanto poupam outros.
Para qualquer pesquisa envolvendo tecidos humanos, questões regulatórias devem ser abordadas. Após os relatórios de Tuskegee e Belmont, houve uma crescente aceitação do fato de que a investigação biomédica foi associada com riscos inerentes, muitas vezes resultando em dilemas éticos inevitáveis 6. A necessidade de normas nacionais e foi reconhecido o governo federal criou Conselhos de Revisão Institucional (IRBs) como um meio para defender os princípios do Relatório Belmont (respeito pelas pessoas, beneficência e justiça).
IRB Qualquer instituição é uma comissão de médicos, pesquisadores e membros da comunidade que são responsáveis por proteger os participantes da pesquisa. Ela exige que o consentimento voluntário ser obtido de todos os participantes de estudos de investigação biomédica, e que este consentimento ser documentados em um consentimento informado fo rm. O processo de consentimento informado tem como objetivo fornecer informações adequadas a um participante, para que uma decisão informada pode ser feita sobre se deve ou não se inscrever em um estudo, ou para continuar a participação. A este respeito, o documento de consentimento informado devem ter boa legibilidade e deve ser escrito em uma linguagem que pode ser facilmente compreendida (6 a 8 de leitura nível) pela população-alvo. A possibilidade de coerção ou influência indevida deve ser minimizado, eo assunto deve ser dado tempo suficiente para considerar a participação. O participante também devem ser autorizados a exercer o seu direito de retirar seu consentimento em qualquer estágio durante o curso do estudo sem penalidade. Consentimento voluntário é um pré-requisito obrigatório para a participação de um sujeito na pesquisa e é também juridicamente eficaz 7.
De acordo com os regulamentos para a protecção da saúde humana sujeita 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), os participantes do estudo devem ser informados do propósito da pesquisa, os procedimentos envolvidos na pesquisa, alternativas à participação, todos os riscos previsíveis e desconfortos (incluindo não só danos físicos mas também possível dano psicológico, social ou econômica, desconforto ou inconveniente), benefícios da investigação para a sociedade e, possivelmente, para o indivíduo, tempo em que o sujeito é esperado para participar, pessoa a contactar para respostas a perguntas ou em caso de lesão ou de emergência relacionadas com a investigação, declaração indicando que a participação é voluntária e que a recusa em participar não acarretará quaisquer consequências ou qualquer perda de benefícios, como um compromisso no atendimento clínico normal que o participante tenha direito a receber como resultado de suas / seus diagnósticos e, finalmente, uma declaração sobre o direito do sujeito a confidencialidade e direito de retirar-o estudo em qualquer altura sem quaisquer consequências. Os espécimes de tecido a partir de participantes que retirar o consentimento durante o curso do estudo não deve ser depositado imediatamente e deve ser esgotado. Renúncia de um ou mais elementos do consentimento informado pode ser obtido a partir do IRB para alguns projetos de pesquisa que não poderia ser feito praticamente sem uma alteração dos elementos exigidos ou para estudos onde os elementos necessários não são aplicáveis. Deve ser tomado muito cuidado para assegurar a confidencialidade dos dados. O Seguro de Saúde Portabilidade e Accountability Act (HIPAA) é uma lei federal que impede o uso ou divulgação de "informações médicas protegidas" (PHI) sem o consentimento por escrito dos participantes. PHI inclui, mas não está limitado a informação transmitida a saúde ou mantida em qualquer forma ou meio e inclui campos que podem ser utilizados para identificar um indivíduo 9.
Através deste trabalho, pretendemos delinear o protocolo que deve ser seguido durante tissue processamento – incluindo aquisições e armazenamento e enfatizar a importância de seguir essas diretrizes rígidas, de modo a minimizar os vieses que podem resultar devido às tensões de um tecido é submetido a extração em cima. Também nos esforçamos para fornecer um breve resumo dos ensaios a jusante ou análise (Figura 1) que podem ser executadas em tais espécimes para que os leitores podem fazer um julgamento qualificado sobre o ensaio (s) melhor se adapte às suas necessidades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em última análise, os métodos de processamento deve ser ditada pela hipótese desejado e antecipado ensaios técnicos para ser executada (Figura 1). A secção que se segue serve como uma visão geral para descrever os ensaios potenciais que podem ser executadas em tais secções de tecido. É de nenhuma maneira uma visão geral exaustiva, mas destina-se a ajudar a orientar os métodos de processamento de amostras e escolha de ensaios a jusante, descrevendo técnicas e listando seus pontos fortes e f…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelas contribuições filantrópicas da John G. e Maria Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0727033) ea Research Alliance Melanoma. Os autores gostariam de agradecer à Universidade de Tissue Texas MD Anderson Cancer Center Institucional Bank (ITB) para coordenar a distribuição de tecidos e recolha e facilitar a investigação translacional, bem como Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, o Departamento de MD Anderson Cancer Center Patologia e do Programa de Melanoma do chute Lua. Por fim, os autores gostariam de agradecer todos os pacientes e famílias afetadas por melanoma.
Materials
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
Referenzen
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