Работа с тканями человека для трансляционных исследований рака
Summary
Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.
Abstract
Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.
Introduction
Медицинские исследования значительную пользу от изучения обеих клеточных линиях человека и животных моделях. Клеточные линии позволяют лучше регулировать компонентов в системе, а также использование клеток из соответствующим организмом. Работа с человеческими клетками, в то время как более представительным, представляет радикально упрощены снимок механизмов, которые могут быть ответственны за здоровье и болезни, потому что клеточные линии, возможно, не повторять воздействие других клеток, стромальных компонентов и органов, которые могут повлиять на ответы 1. С другой стороны, модели на животных, хотя и не совсем точно воспроизвести заболевание человека и генетическую гетерогенность, предлагают дальнейшее понимание, позволяя для ввода целых систем животных в большинстве моделей 2,3.
Недостатки в сторону, оба метода имеют свои преимущества и дополняют друг друга. Тем не менее, основная цель остается, чтобы изучить человеческие клетки и органы, в полном объеме тела, многопартийной системы органов. Соответственно, трансляционные исследования имеет Takан больших успехов в облегчая изучение органов и тканей человека, извлеченных из пациентов, для того, чтобы лучше понять механизмы основного заболевания. Поступательное исследование предлагает преимущество изучения результат лечения заболеваний и во всем теле и в соответствующих клетках, тем самым обеспечивая лучшее из обоих миров между клеток и животных работы 4.
Поступательное исследование также не без изъянов. Собранные образцы от пациентов человека, при удалении от хозяина, сразу же подвергается ишемии и других внешних факторов, из которых они будут иначе охраняемых. Это может привести к молекулярно-генетических изменений, вызванных стрессом, и вызвать смещение в последующих исследований. Таким образом, много усилий было вложено в добыче и переработке тканей с помощью строгих методов лучше сохранить орган и целостность клеток для последующих исследований 5. Важно отметить, что будущие приложения должны быть рассмотрены внимательно при выборе методов уплотнительныее обработки проб человека, а некоторые методы могут быть вредны для клеточных компонентов и сигнальных путей, щадя других.
Для любого исследований с участием человека тканей, регуляторные вопросы должны быть решены. После докладов Tuskegee и Белмонт, был растущее признание того факта, что биомедицинские исследования было связано с неотъемлемые риски часто приводит к неизбежным этических дилемм 6. Необходимость национальных стандартов была признана и федеральное правительство создало институциональные наблюдательные советы (IRBS) в качестве средства для отстаивания принципов Belmont Report (уважение к личности, благодеяния, справедливость).
IRB любое учреждение является комитет врачей, исследователей и членов сообщества, которые отвечают за обеспечение защиты участников исследования. Он требует, чтобы добровольное согласие быть получены от всех участников биомедицинских исследований, и что это согласие документально в информированного согласия FO гт. Информированный процесс согласия призван обеспечить адекватную информацию для участника, так что обоснованное решение может быть от того, чтобы не поступать в исследовании, или продолжать участие. В связи с этим, документ о согласии должны иметь хорошую читаемость и должны быть написаны на языке, который может быть легко понимаемой (6-го по 8-й этап обучения чтение) для целевой популяции. Возможность принуждения или ненадлежащего влияния должны быть сведены к минимуму, и предметом должно быть дано достаточно времени, чтобы рассмотреть вопрос об участии. Участник также должен иметь возможность осуществлять свое право отозвать согласие на любом этапе в ходе исследования без штрафа. Добровольное информированное согласие является обязательным предварительным условием для участия субъекта в исследовании, и это также юридическую силу 7.
В соответствии с правилами по защите прав субъектов 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), участники исследования должны быть проинформированы о целях исследования, процедуры, участвующих в исследовании, альтернативы участия, все прогнозируемые риски и неудобства (в том числе не только физической травмы, но и возможного психологического, социального или экономического ущерба, дискомфорт или неудобство), пособия исследования для общества и, возможно, к личности, продолжительность предметом, как ожидается, участие, контактное лицо для ответов на вопросы или в случае травмы исследований, связанных с или чрезвычайной ситуации, заявление о том, что участие является добровольным и что отказ от участия не приведет к каких-либо последствий или любой потери преимуществ, таких как компромисс в очередной медицинской помощи что участник в противном случае право на получение в результате его / ее диагнозов, и, наконец, заявление о праве субъекта на конфиденциальность и право на выход изисследование в любое время без каких-либо последствий. Образцы ткани из участников, которые аннулируют согласие в ходе исследования не следует рассчитывали и должны быть немедленно исчерпаны. Отказ от одного или более элементов информированного согласия, могут быть получены из IRB для некоторых научно-исследовательских проектов, которые не могут быть практически сделано без изменения до требуемых элементов или для исследований, где требуется элементы не применимы. Большое внимание должно быть принято, чтобы обеспечить конфиденциальность данных. Страховая Мобильность Здоровье и Акт об ответственности (HIPAA) является федеральный закон, который предотвращает использование или раскрытие "конфиденциальную медицинскую информацию" (PHI) без письменного согласия участников. PHI включает, но не ограничивается медицинской информации, передаваемой или сохраняемой в любой форме или средней и включает в себя поля, которые могут быть использованы для идентификации отдельного 9.
Благодаря этой работе, мы стремимся, чтобы наметить протокол, который следует соблюдать в процессе Tissuэлектронной обработки – в том числе закупки, хранение и подчеркивают важность следующие строгие правила таким образом, чтобы свести к минимуму отклонения, которые могут возникнуть в результате из-за стрессов ткани подверженного при экстракции. Мы также стремимся предоставить краткий обзор последующих анализов или анализов (рисунок 1), которые могут быть выполнены на таких образцов, так что читатели могут сделать квалифицированный суждение о каком анализе (ов) наилучшим образом отвечает их потребностям.
Protocol
Representative Results
Discussion
В конечном счете, методы обработки должны быть продиктован желаемого гипотезы и ожидалось технические анализы должны быть выполнены (рисунок 1). В следующем разделе служит обзором описания возможных анализов, которые могут быть выполнены на таких срезах тканей. Это не в коем с…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана благотворительных взносов Джона Г. и Мэри Stella Кенеди Мемориального фонда (грант # 0727033) и научно-исследовательского альянса меланомы. Авторы хотели бы поблагодарить Университет Техаса MD Anderson Cancer Center Институциональная банк тканей (ITB) для координации распределения в тканях и сбор и содействия трансляционные исследования, а также д-р Игнасио Wistuba, д-р Виктор Прието, в MD Anderson Cancer Center Департамента Патология и удара Программа Меланома Луна. Наконец, авторы выражают признательность всем пациентам и их семьям, пострадавшим от меланомы.
Materials
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
Referenzen
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , (2010).
- McCabe, P. M., et al. Animal models of disease. Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M., Gilbert, N. The ethics of social research. Researching social life. , 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. . IRB guidebook. , (1993).
- . . MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, (2009).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -. Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemie. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nat Genet. 32, 526-532 (2002).
