Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
Il sistema nervoso enterico (ENS) gioca un ruolo importante nella regolazione gastrointestinale (GI) motilità e può funzionare indipendentemente dal sistema nervoso centrale. Cambiamenti nella funzione ENS sono una delle principali cause di sintomi gastrointestinali e malattie e possono contribuire a sintomi gastrointestinali riportati in disturbi neuropsichiatrici, tra cui l'autismo. E 'ben noto che isolati segmenti del colon generano spontanei, contrazioni ritmiche note come colon Migrazione motore Complessi (CMMCs). Una procedura per analizzare la regolazione neurale enterica di CMMCs in ex vivo preparazioni di due punti del mouse è descritto. Il colon è sezionato dall'animale e lavato per rimuovere i contenuti fecale prima di essere cannulate in un bagno d'organo. I dati vengono acquisite tramite una telecamera posizionata sopra la vasca organo e convertito in mappe spazio-temporali ad alta risoluzione tramite un pacchetto software in-house. Utilizzando questa tecnica, i modelli contrattili di base e gli effetti farmacologici sulla funzione ENS a colon segments possono essere confrontati più di 3-4 ore. Inoltre, la lunghezza e la velocità di propagazione di CMMCs possono essere registrate così come i cambiamenti di diametro intestino e la frequenza di contrazione. Questa tecnica è utile per la caratterizzazione di modelli della motilità gastrointestinale in modelli di topi transgenici (e in altre specie, tra cui ratti e cavie). In questo modo, i cambiamenti indotti farmacologicamente in CMMCs sono registrati nei topi wild-type e nel modello di topo R451C neuroligin-3 di autismo. Inoltre, questa tecnica può essere applicata ad altre regioni del tratto gastrointestinale compreso il duodeno, digiuno e ileo e a diverse età dello sviluppo nei topi.
Introduction
Il sistema nervoso enterico (ENS) è la rete neuronale intrinseca del tratto gastrointestinale e modula diverse funzioni come la digestione del contenuto intestinale, l'assorbimento delle sostanze nutritive e la secrezione e riassorbimento di fluido. I neuroni del ENS si trovano nelle mienterici e sottomucosa plessi. Il plesso mioenterico svolge un ruolo importante nella regolazione della motilità gastrointestinale 1 mentre il plesso sottomucoso è principalmente coinvolto nel controllo della secrezione 2,3. Il plesso mioenterico si trova tra gli strati muscolari longitudinali e circolari della parete gastrointestinale. L'attività contrattile degli strati muscolari lisce della parete intestinale facilita le funzioni primarie del tratto gastrointestinale mescolando e propulsione contenuto intestinale lungo la lunghezza dell'intestino 3. Sebbene l'innervazione estrinseca al tratto gastrointestinale dal CNS contribuisce alla funzione gastrointestinale in vivo, L'ENS è in grado di regolare la funzione gastrointestinale in modo indipendente. Questa caratteristica unica permette l'indagine funzionale dei circuiti neuronali enterici e il loro contributo alla motilità gastrointestinale ex vivo.
Colon migrazione complessi a motore (CMMCs) sono spontanee, eventi neurogene che sono il modello del motore predominante osservato nel colon isolato mouse in assenza di pellet fecali 4-9. CMMCs sono definiti come contrazioni ritmiche che si propagano lungo una distanza orizzontale che è almeno metà della lunghezza totale del colon (cioè, dal cieco al retto) 10. Il rapporto tra CMMCs e gli schemi contrattili che spingono pellet fecali è ancora da essere chiaramente stabilita, tuttavia alcune differenze farmacologiche sono stati segnalati 11. Tuttavia, la capacità del ENS di funzionare indipendentemente del SNC e l'esistenza di schemi motori neurali mediata nella SIcolon olated fornisce un sistema di test ideale per esaminare i disturbi della motilità che derivi dalla sottostante disfunzione ENS. La spontaneità di schemi motori gastrointestinali permette cambiamenti funzionali in risposta a stimoli farmacologici da valutare.
L'uso di immagini video e mappatura spazio-temporale è stato sviluppato per esaminare quantitativamente piccolo peristalsi intestinale nelle cavie 12. Qui, una tecnica ex vivo è descritto che consente lo studio di topo modelli di motilità del colon utilizzando immagini video e l'analisi di queste registrazioni per costruire ad alta risoluzione (~ 100 micron, 33 msec) mappe del diametro del colon in funzione della posizione lungo il colon e di tempo (mappe spazio-temporali). L'utilizzo in-house software di rilevamento dei bordi (Analyse2; a richiesta), i dati di piena lunghezza segmenti del colon contraente in tempo reale vengono elaborate per generare mappe spazio-temporali per ogni esperimento. In questa fase, i file video (AVI) sono summarizzato e convertito in mappe spazio-temporali che utilizzano Analyse2. Mappe spazio-temporali (Figura 2) descrivono contrattilità nel tempo e consentono di misurare più parametri quali la velocità di propagazione, ampiezza, lunghezza e durata. diametro Gut è registrato anche per tutta la durata dell'esperimento come misura della contrattilità complessiva del segmento tissue. Questo metodo può essere applicato per identificare differenze nel punto di innesco di complessi contrattili che potrebbe indicare connettività neuronale enterica alterata.
Un simile protocollo video di imaging progettato per valutare pellet propulsione in cavie 'stato segnalato 13 tuttavia qui descriviamo l'applicazione dell'approccio immagini video per la quantificazione della motilità del colon spontanea (cioè in assenza di pellet). Forniamo anche informazioni dettagliate per facilitare la dissezione e preparazione del tessuto gastrointestinale per l'approccio di immagini video. Questoprotocollo fornisce ai ricercatori con uno strumento accessibile e facilmente replicato per l'analisi enterico controllo neurale della funzione gastrointestinale in modelli animali di malattie tra cui modelli genetici di topo.
La tecnica di immagini video permette l'analisi della motilità del colon in risposta a vari agenti farmacologici. I farmaci possono essere somministrati tramite lume intestinale o il bagno per organi esterni alla preparazione del colon. Diverse regioni del tratto gastrointestinale topo mostrano modelli di motilità specifici come piccola segmentazione intestinale e CMMCs nel colon.
Questa tecnica è stata utilizzata per identificare le differenze di deformazione in piccola funzione intestinale; sensibilità differenziale 5-HT 3 e 5-HT 4 antagonisti sono stati osservati nel digiuno di Balb / c topi C57 / BL6 causa della natura polimorfica del gene TPH2 espressa nei due ceppi 6. L'effetto di inibizione 5-HT sulla motilità rimane controversa, come dati contrastanti stato segnalato l'importanza di endogena 5-HT su peristalsi del colon e CMMCs 14,15. Alterazioni della motilità pre e dopo la nascita durante lo sviluppo 7, e gli effetti di mutazioni del gene sulla motilità gastrointestinale in modelli animali di malattia 10 possono essere esaminati anche dal utilizzando immagini video. Qui illustriamo uso del metodo per lo studio della motilità del colon nel modello murino NL3 R451C di autismo, che esprime una mutazione missense nel gene che codifica per la NLGN3 sinaptica proteina di adesione neuroligin-3 16. Questa mutazione è stato identificato in pazienti con diagnosi di disturbo dello spettro autistico (ASD) 17, che è fortemente associato con IG disfunzioni 18-22. Abbiamo studiato se la mutazione sinaptica NL3 R451C colpisce uscite neurali nel ENS con la tecnica video di imaging. Presentiamo i dati che caratterizzano CMMCs al basale e in risposta alla 5H serotoninergicaT 3/4 antagonista del recettore tropisetron nel modello murino NL3 R451C di autismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando questa tecnica di imaging video, frequenza CMMC è stata misurata come un'indicazione di motilità del colon in topi wild-type e NL3 R451C, un modello murino di spettro autistico disturbo 17. I nostri risultati indicano una riduzione del numero di CMMCs nei topi mutanti NL3 R451C rispetto ai topi wild-type in presenza del 5HT 3/4 antagonista del recettore Tropisetron suggerendo che i topi NL3 R451C mostrano una maggiore sensibilità agli Tropisetron….
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB e ELH-Y sono stati sostenuti dal Dipartimento della Difesa statunitense CDMRP Programma Autism Research (AR11034). NHMRC (1047674) per ELH-Y.The maggio Stewart Bursary-Università di Melbourne fiducia finanziato borse di studio a MS. Ringraziamo Ali Taher, Fátima Ramalhosa e Gracia Seger per i contributi tecnici.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Referenzen
- Powell, A. K., O’Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung’s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung’s disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung’s disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?. Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
