Vídeo Imagem e Mapas espaço-temporais para analisar Motilidade Gastrointestinal em Ratos

Summary

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Abstract

O sistema nervoso entérico (ENS) desempenha um papel importante na regulação da motilidade gastrintestinal (GI) e podem funcionar de forma independente do sistema nervoso central. As alterações na função ENS são uma causa importante de sintomas gastrointestinais e doença e pode contribuir para os sintomas gastrointestinais relatados em desordens neuropsiquiátricas incluindo autismo. Está bem estabelecido que os segmentos de cólon isolados gerar contrações espontâneas, rítmicos conhecido como Colônica Migração Motor Complexos (CMMCs). Um procedimento para analisar a regulação neural entérica de CMMCs em ex vivo preparações de cólon do rato é descrita. O cólon é dissecado a partir do animal e lavada para remover o conteúdo de fezes antes de ser canulada num banho de órgãos. Os dados são adquiridos por meio de uma câmara de vídeo posicionado acima do banho do órgão e convertidos em mapas de alta resolução espaço-temporais através de um pacote de software em casa. Usando esta técnica, os padrões contráteis linha de base e efeitos farmacológicos sobre a função ENS no cólon segments podem ser comparados ao longo de 3-4 h. Além disso, o comprimento de propagação e velocidade de CMMCs podem ser gravados, bem como alterações no diâmetro do intestino e frequência de contração. Esta técnica é útil para caracterizar os padrões de motilidade gastrointestinal em modelos de ratinho transgénicos (e em outras espécies, incluindo ratos e cobaia). Desta forma, as alterações induzidas farmacologicamente em CMMCs são registadas em ratinhos de tipo selvagem e no modelo de ratinho ^R451C neuroligin-3 de autismo. Além disso, esta técnica pode ser aplicada a outras regiões do tracto gastrointestinal, incluindo o duodeno, jejuno e íleo e em diferentes idades de desenvolvimento em ratinhos.

Introduction

O sistema nervoso entérico (ENS) representa a rede neuronal intrínseca do tracto gastrointestinal e modula várias funções, tais como a digestão do conteúdo intestinal, absorção de nutrientes e a secreção e reabsorção de fluido. Neurônios do ENS estão localizados nas mioentéricos e submucoso plexos. O plexo mientérico desempenha um papel importante na regulação da motilidade gastrointestinal ¹ ao passo que o plexo submucosa é principalmente envolvida no controlo da secreção de ^2,3. O plexo mientérico está situado entre as camadas de músculo circular e longitudinal da parede gastrointestinal. A actividade contráctil das camadas de músculo liso da parede intestinal facilita as funções primárias do tracto gastrointestinal através da mistura e impulsionando conteúdo intestinal ao longo do comprimento do intestino ^3. Embora o fornecimento do nervo extrínseca ao tracto gastrointestinal do SNC contribui para a função gastrointestinal in vivo, O ENS é capaz de regular a função gastrointestinal de forma independente. Esta característica única permite a investigação funcional dos circuitos neuronais entéricas ea sua contribuição para a motilidade gastrointestinal ex vivo.

Colo complexos motor migrante (CMMCs) são espontâneos, eventos neurogénicos que são o padrão motor predominante observado no rato cólon isolado na ausência de partículas fecais ^4-9. CMMCs são definidos como contracções rítmicas que se propagam ao longo de uma distância horizontal que é pelo menos metade do comprimento total do cólon (ou seja, a partir do ceco até ao recto) ^10. A relação entre CMMCs e os padrões contráteis que impulsionam pelotas fecais está ainda a ser claramente estabelecida, no entanto, algumas diferenças farmacológicas foram relatados ^11. No entanto, a capacidade do ENS a funcionar independentemente do SNC e a existência de padrões motores mediada por neurais na IScólon olated proporciona um sistema de ensaio ideal para examinar distúrbios na motilidade resultantes da disfunção subjacente ENS. A espontaneidade dos padrões motores gastrointestinais permite alterações funcionais em resposta a estímulos farmacológicos a ser avaliada.

O uso de imagens de vídeo e mapeamento espaço-temporal foi desenvolvido pela primeira vez para analisar quantitativamente pequena peristaltismo intestinal em cobaias ^12. Aqui, uma técnica ex vivo é descrito que permite o estudo de rato padrões de motilidade do cólon usando imagens de vídeo e a análise destas gravações para a construção de alta resolução (~ 100 uM, 33 mseg) mapas de diâmetro do cólon em função da posição ao longo do cólon e de tempo (mapas espaço-temporais). Usando o software in-house detecção de flanco (Analyse2; disponível a pedido), os dados de todo o comprimento do cólon segmentos contratantes em tempo real são processados ​​para gerar mapas espaço-temporais para cada experimento. Nesta etapa, arquivos de vídeo (AVI) são summazado e convertido em mapas espaço-temporais usando Analyse2. Mapas espaço-temporais (Figura 2) retratam a contratilidade ao longo do tempo e permitir a medição de vários parâmetros, incluindo velocidade de propagação, magnitude, extensão e duração. Gut diâmetro é também registado em toda a duração da experiência como uma medida da contractilidade global do segmento de tecido. Este método pode ser aplicado para identificar diferenças no ponto de início de complexos contrácteis que poderia indicar a conectividade neural entérico alterada.

Um protocolo de imagens de vídeo semelhante concebido para avaliar sedimento de propulsão em cobaias foi avaliado ¹³ no entanto aqui descrevemos a aplicação da abordagem de imagens de vídeo para a quantificação da motilidade do cólon espontânea (isto é, na ausência de peletes). Nós também fornecemos informações detalhadas para ajudar na dissecção e preparação do tecido gastrointestinal para a abordagem de imagem de vídeo. esteprotocolo fornece aos pesquisadores uma ferramenta acessível e facilmente replicado para análise de controle neural entérica da função gastrointestinal em modelos animais da doença, incluindo modelos genéticos do rato.

A técnica de imagiologia de vídeo permite a análise da motilidade do cólon em resposta a vários agentes farmacológicos. Os fármacos podem ser administrados através do lúmen do intestino ou ao banho de órgãos externos para a preparação do cólon. Diferentes regiões do tracto gastrointestinal de rato exibem padrões de motilidade específicas tais como pequena segmentação CMMCs intestinal e no cólon.

Esta técnica tem sido utilizada para identificar diferenças de estirpes em pequena função intestinal; sensibilidade diferencial de _5-HT3 e _5-HT4 antagonistas foram observados no jejuno de ratinhos Balb / c e C57 / BL6, devido à natureza polimórfico do gene TPH2 expressa nas duas estirpes ^6. O efeito de inibição da 5-HT sobre a motilidade permanece concontroversa, como dados conflitantes tem sido relatado sobre a importância da endógena 5-HT sobre o peristaltismo do cólon e CMMCs ^14,15. As alterações na motilidade e pré-pós-natal durante o desenvolvimento e ^7, os efeitos de mutações genéticas na motilidade gastrointestinal em modelos animais de doenças ¹⁰ também pode ser examinado por utilização de imagem de vídeo. Aqui, ilustramos a utilização do método para um estudo da motilidade do cólon, no modelo de ratinho de NL3 ^R451C autismo, o qual expressa uma mutação sem sentido no gene que codifica a proteína NLGN3 adesão sináptica neuroligin-3 ^16. Esta mutação foi identificada pela primeira vez em pacientes diagnosticados com transtorno do espectro do autismo (ASD) ^{17, que} está fortemente associada com disfunção GI ^18-22. Nós investigamos se a mutação sináptica NL3 R451C afeta saídas neurais no ENS utilizando a técnica de imagem de vídeo. São apresentados dados que caracterizam CMMCs na linha de base e, em resposta ao 5H serotonérgicaT _3/4 receptor antagonista tropissetrom no modelo de ratinho de NL3 ^R451C de autismo.

Protocol

manejo dos animais e deslocamento cervical de animais antes de todas as experiências foram realizadas estritamente de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Experimentação Animal da Universidade de Melbourne (Ética ID: 1.212.494,7) 1. Tissue Recolha e Dissection Euthanize camundongos adultos por deslocamento cervical. Se possível evitar a anestesia para evitar influências sobre a função intestinal através de receptores localizados em populações neuronais de intere…

Representative Results

Até 90% dos pacientes com TEA experimentar uma variedade de desordens gastrintestinais, incluindo a diarreia e a constipação 18,24,25. No entanto, as causas subjacentes a estes problemas gastrointestinais são desconhecidos. Muitas mutações identificadas em pacientes com ASD estão associados a proteínas sinápticas contribuindo para alterações e perturbações na transmissão ou função sináptica. Uma tal mutação, no gene que codifica para a molécula de adesão c…

Discussion

Usando esta técnica de imagem de vídeo, a frequência CMMC foi medida como uma indicação da motilidade do cólon em ratos de tipo selvagem e NL3 ^R451C, um mouse modelo de transtorno do espectro do autismo ^17. Os nossos resultados indicam uma redução no número de CMMCs em ratinhos mutantes NL3 ^R451C, em comparação com ratinhos de tipo selvagem na presença do antagonista selectivo do receptor 5HT _3/4 Tropisetron sugerindo que os ratinhos NL3 ^R451C exibem uma…

Materials

Reagents
NaCl (MW: 58.44)	Sigma-Aldrich	S7653-250G
KCl (MW: 74.55)	Sigma-Aldrich	P9333-500G
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01)	Chem Supply	471-500G
MgSO4.7H20 (MW: 246.48)	Chem Supply	MA048
CaCl2.2H2O (MW: 147.02)	Chem Supply	CA033
D-Glucose anhydrous (MW: 180.16)	Chem Supply	GA018-500G
NaHCO3 (MW: 84.01)	Chem Supply	GA018-500G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm	Custom Made		Contact Laboratory Directly
732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR	Dow Corning Australia Pty Ltd	1890573
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning Australia Pty Ltd	1064291
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S	Terumo Medical Corporation	0912-2006
SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL	Terumo Medical Corporation	N/A
1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing	Masterflex	508-008
1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing	Masterflex	508-005
1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing	Masterflex	508-007
1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing	Masterflex	96410 – 14
4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing	Masterflex	96410 – 15
3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing	Masterflex	96410 -16
Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml	Thermofisher Scientific	100-400
CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm
CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm
Water heater  (thermo regulator)	Ratek	TH7000
Logitech Webcam	Logitech
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Virtual Dub – 1.9 11	virtualdub.org
MATLAB R2012a	Graph Pad
Logitech Webcam Software	Logitech