Видео с изображениями и Пространственно-временные Карты для анализа моторику желудочно у мышей
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
Энтеросолюбильное нервной системы (ENS) играет важную роль в регуляции желудочно (ГИ) подвижность и может функционировать независимо от центральной нервной системы. Изменения функции ENS являются основной причиной симптомов GI и болезни и может способствовать желудочно-кишечные симптомы, зарегистрированных в нервно-психических расстройств, включая аутизм. Хорошо известно, что изолированные сегменты кишки генерировать спонтанные, ритмические сокращения, известные как ободочной мигрирующий моторный комплекс (CMMCs). Процедура для анализа кишечно нервной регуляции CMMCs в Экс Vivo препараты толстой кишки мыши описана. Толстой кишки рассекают от животного и промыть, чтобы удалить фекальные содержание до того, как канюлю в ванночку. Данные приобрела с помощью видеокамеры, расположенной над ванночку и преобразуется в высоком разрешении пространственно-временных карт с помощью пакета программного обеспечения в доме. Используя эту технику, базовые модели сократительные и фармакологическое действие на функции ENS в толстой кишки сegments можно сопоставить по 3-4 ч. Кроме того, длина распространения и скорость CMMCs могут быть записаны, а также изменения в диаметре кишки и частоты сокращений. Этот метод полезен для характеристики желудочно-кишечной активности узоры в трансгенных мышах (и в других видов, включая крыс и морских свинок). Таким образом, фармакологически индуцированные изменения в CMMCs записываются в мышей дикого типа и в мышиной модели R451C нейролигины-3 аутизма. Кроме того, этот метод может быть применен и в других регионах желудочно-кишечного тракта, включая двенадцатиперстной кишки, тощей и подвздошной кишки и в различном возрасте развития у мышей.
Introduction
Энтеросолюбильное нервной системы (ENS) представляет собой характеристическую нейронной сети из желудочно-кишечного тракта и модулирует различные функции, такие как переваривание содержимого кишечника, всасывание питательных веществ и секреции и реабсорбции жидкости. Нейроны ENS находятся в мышечной оболочки кишечника и подслизистой сплетения. Мышечной оболочки кишечника сплетения играет важную роль в регуляции желудочно-кишечного 1 тогда подслизистой сплетения в основном занимается контролем секреции 2,3. Мышечной оболочки кишечника сплетения расположен между продольными и круговыми слоями мышечных желудочно-стены. Сократительной активности слоев гладких мышечных кишечной стенки облегчает первичные функции желудочно-кишечного тракта путем смешивания и метательные кишечного содержимого по длине кишечника 3. Хотя внешняя иннервация желудочно-кишечного тракта из ЦНС способствует функции желудочно-кишечного в естественных, То ЭНС способен регулировать функции желудочно-кишечного независимо. Это уникальное свойство позволяет функциональную расследование кишечных нервных цепей и их вклад в желудочно-кишечного экс естественных.
Толстокишечные мигрирующий моторный комплекс (CMMCs) спонтанные, нейрогенные события, которые являются преобладающими узор двигателя наблюдается в изолированной толстой кишке мышей в отсутствие фекальных шариков 4-9. CMMCs определяются как ритмических сокращений, которые распространяются вдоль горизонтального расстояния, что, по меньшей мере половина общей длины толстой кишки (т.е., от слепой кишки до прямой кишки) 10. Отношения между CMMCs и узоров сократительных которые продвигают фекальные шарики еще четко установлено, однако некоторые фармакологические различия были зарегистрированы 11. Тем не менее, способность ENS функционировать независимо от ЦНС и существование нейронных опосредованного моделей моторных в ISolated толстой кишки представляет собой идеальную аналитическую систему для изучения нарушений в подвижности в результате основной дисфункции ENS. Спонтанность желудочно-кишечных моделей моторных позволяет функциональные изменения в ответ на фармакологические раздражители должны быть оценены.
Использование видео изображений и пространственно-временной картографии была впервые разработана количественно изучить небольшой перистальтику кишечника у морских свинок 12. Здесь, экс виво методика описана, что позволяет исследовать мыши ободочной узоров моторики с использованием видео изображений и анализ этих записей, чтобы построить с высоким разрешением (~ 100 мкм, 33 мсек) карты толстокишечной диаметром как функция положения вдоль толстой кишки и времени (пространственно-временных карт). Использование ПО в доме детектирования кромки (Analyse2; предоставляется по запросу), данные из полноразмерных ободочной сегментов сжимается в реальном времени обрабатываются для генерации пространственно-временных карт для каждого эксперимента. На этом этапе, видеофайлы (AVI) являются отличиемавторизованном и преобразуется в пространственно-временных карт с использованием Analyse2. Пространственно-временные карты (Рисунок 2) изображают сократимость течением времени и позволяет измерять нескольких параметров, включая скорость распространения, величине длины и продолжительности. Диаметр Gut также записывается в течение всего срока эксперимента в качестве меры общей сократимости сегмента ткани. Этот метод может быть применен для идентификации различий в точки инициации сократительных комплексов, которые могут указывать измененное кишечно нейронную связь.
Аналогичный протокол видеоизображения предназначен для оценки гранул тягу у морских свинок было сообщено 13 однако здесь мы приводим применение подхода визуализации видео для количественного определения спонтанной моторику толстого кишечника (т.е. при отсутствии гранул). Мы также предоставить подробную информацию для содействия в вскрытия и подготовки желудочно-кишечной ткани для подхода видео изображения. ЭтаПротокол предоставляет исследователям доступной и легко тиражироваться инструмента для анализа кишечно нейронной контроль функции желудочно-кишечного в животных моделях болезни включая генетические мышиных моделях.
Методика видеоизображения позволяет анализировать моторику толстого кишечника в ответ на различные фармакологические препараты. Препараты могут быть введены с помощью просвета кишечника или ванночку внешними по отношению к ободочной подготовки. В разных регионах мыши желудочно-кишечного тракта проявляют определенные шаблоны моторики, такие как тонкого кишечника сегментации и CMMCs в толстой кишке.
Этот метод был использован для идентификации штамма различия в небольшом функции кишечника; дифференциальная чувствительность к 5-НТ 3 и 5-HT 4 антагонистов наблюдались в тощей кишке BALB / C и C57 / BL6 мышей вследствие полиморфной природы гена tph2 выраженной в двух штаммов 6. Эффект 5-НТ ингибированием моторики остается конспорными, так как противоречивые данные Сообщалось о важности эндогенного 5-НТ на толстой перистальтики и CMMCs 14,15. Изменения в подвижности до- и послеродовом периоде при развитии 7, и последствия генных мутаций на желудочно-кишечного в животных моделях болезни 10 также могут быть рассмотрены с использованием видеоизображения. Здесь мы проиллюстрируем применение метода для исследования толстой моторики в мышиной модели NL3 R451C аутизма, который выражает миссенс-мутации в гене Nlgn3 кодирующий синаптическую адгезии белка нейролигины-3 16. Эта мутация была впервые идентифицирована в пациентах с диагнозом расстройства аутистического спектра (ASD) 17, который прочно ассоциируется с GI дисфункции 18-22. Мы исследовали, влияет ли синаптической мутация NL3 R451C нейронных выходов в ENS, используя технику видео изображений. Мы представляем данные, характеризующие CMMCs исходно и в ответ на серотонинергической 5НТ антагонист трописетрон 3/4 рецептора в мышиной модели NL3 R451C аутизма.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя эту технику визуализации видео, частота CMMC измеряли как показатель моторику толстого кишечника в дикого типа и мышей NL3 R451C, мышиной модели расстройства аутистического спектра 17. Наши результаты свидетельствуют о снижении числа CMMCs в мутантных мышей NL3 R451C по…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB и ELH-Y были поддержаны Департаментом США программы обороны CDMRP аутизма исследований (AR11034). NHMRC (1047674), чтобы ELH-ности У. мая Stewart Стипендии-Университета Мельбурна доверия финансируется стипендию РС. Мы благодарим Али Тахер, Фатима Ramalhosa и Gracia Seger по техническим взносов.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Referenzen
- Powell, A. K., O’Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung’s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung’s disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung’s disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?. Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
