Video Görüntüleme ve Spatiotemporal Haritalar Fare Gastrointestinal Motilite Analiz
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
Enterik sinir sistemi (ENS) mide-bağırsak (Gl) motilite düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve birbirinden bağımsız olarak, merkezi sinir sisteminin işlev görebilir. ENS fonksiyonundaki değişiklikler GI semptomları ve hastalığın başlıca nedenidir ve otizm dahil nöropsikiyatrik bozukluklarda bildirilen GI belirtileri katkıda bulunabilir. Iyi izole kolon segmentleri Kolon Geçiş Motor Külliyesi (CMMCs) olarak bilinen spontan, ritmik kasılmaları oluşturmak olduğunun tespit edilmesi. Bir prosedür, fare kolon in vivo preparasyonlar tarif edilmektedir Ex CMMCs enterik nöral düzenleme analiz etmek. Kolon hayvan disseke ve önce organ banyosuna kanül olmanın dışkı içeriği kaldırmak için temizlendi. Veri organ banyosuna üzerine yerleştirilmiş bir video kamera aracılığı ile edinilen ve bir in-house yazılım paketi ile yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal haritalar dönüştürülür. Bu tekniği, temel kasılma desen ve kolon s ENS fonksiyonu üzerinde farmakolojik etkilere kullanmaegmentler 3-4 saat boyunca karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, CMMCs yayılma süresi ve hız bağırsak çapı ve kasılma sıklığındaki değişiklikler gibi kaydedilebilir. Bu teknik, transgenik fare modellerinde (ve sıçan ve gine domuzu gibi diğer türlerde), mide bağırsak hareket kabiliyeti desenleri karakterize etmek için yararlıdır. Bu şekilde, farmakolojik olarak CMMCs uyarılan değişiklikler, vahşi tipli fare ve otizm neuroligin-3 R451C fare modelinde kaydedilir. Ayrıca, bu tekniğin duodenum, jejunum ve ileum içeren ve farelerde farklı gelişim yaşlarda GI sisteminin diğer bölgelerine tatbik edilebilir.
Introduction
Enterik sinir sistemi (ENS) mide-bağırsak sisteminin iç nöronal ağ ve bağırsak içeriğinin sindirim, besin emilmesi ve salgılama ve akışkan geri emmek gibi çeşitli fonksiyonları modüle eder. ENS nöronları myenterik ve submukozal pleksuslar yer almaktadır. Miyenteron pleksusu submukozal pleksus ise mide-bağırsak motilitesini 1 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar salgılama 2,3 kontrolünde ilgilenmektedir. miyenteron pleksusu mide duvarında uzunlamasına ve dairesel kas tabakaları arasında yer almaktadır. Intestinal çeperin yumuşak kas tabakaları kasılma aktivitesi karıştırma ve bağırsak 3 uzunluğu boyunca bağırsak içeriği itilmesi ile mide-bağırsak sisteminin birincil işlevleri kolaylaştırmaktadır. CNS gelen sindirim yollarında dışsal sinir besleme in vivo gastrointestinal fonksiyon katkıda rağmen, ENS, bağımsız bir gastrointestinal fonksiyon düzenleme yeteneğine sahiptir. Bu eşsiz özellik fonksiyonel enterik nöronal devrelerin soruşturma ve ex vivo gastrointestinal motilite katkılarını sağlar.
Kolon göç motorlu kompleksleri (CMMCs) fekal pelet 4-9 yokluğunda izole fare kolon gözlenen baskın motorlu model olan spontane, nörojenik olaylardır. CMMCs 10 (rektum çekum örneğin,) en azından iki nokta üst üste yarısı toplam uzunluğu olan yatay mesafe boyunca ilerler ritmik kasılmalar olarak tanımlanır. CMMCs ve fekal pelet itmek kasılma desen arasındaki ilişki henüz açıkça kurulacak olan ancak bazı farmakolojik farklılıklar 11 bildirilmiştir. Bununla birlikte, MSS bağımsız çalışması için ENS yeteneği ve DİR nöral aracılı motorlu desen varlığıolated kolon altında yatan ENS disfonksiyonu kaynaklanan motilite bozuklukları incelemek için ideal bir tahlil sistemi sağlar. gastrointestinal motor desen kendiliğinden farmakolojik uyarıcıya tepki olarak fonksiyonel değişiklikler değerlendirilmesine olanak tanır.
Video görüntüleme ve uzaysal haritalama kullanımı ilk nicel kobay 12 ince bağırsak peristalsis incelemek için geliştirilmiştir. Burada, bir ex vivo tekniği yüksek çözünürlüklü oluşturmak için video görüntü ve bu kayıtların analizi kullanılarak, fare kolon hareket kabiliyeti desen çalışma sağlayan açıklanan (~ 100 um, 33 msn) kolon boyunca pozisyonun bir fonksiyonu olarak kolon çapı harita ve zaman (Spatiotemporal haritalar) evi. in-house kenar algılama yazılımını kullanarak (Analyse2; istek üzerine), gerçek zamanlı olarak daralan tam uzunlukta kolon segmentlere veriler, her bir deney için zamanmekansal haritaları oluşturmak için işlenir. Bu adımda, video (AVI) dosyaları toplamı olanyetkilendirilmiş ve Analyse2 kullanarak Spatiotemporal haritalara dönüştürülür. Zamanmekansal haritalar (Şekil 2) zamanla kasılma tasvir ve yayılma hızı, büyüklüğü, uzunluğu ve süresi de dahil olmak üzere çok sayıda parametrelerinin ölçümünü sağlar. Gut çapı doku bölümünün genel kasılma bir ölçüsü olarak deney süresi boyunca kaydedilmektedir. Bu yöntem, değiştirilmiş enterik nöral bağlantı gösterebilir kontraktil komplekslerinin başlatma alanına farklılıkları belirlemek için uygulanabilir.
Kobaylarda pelet tahrik değerlendirmek için tasarlanmış benzer bir video görüntüleme protokolü, ancak burada (pelet yokluğunda, örneğin), spontan bağırsak motilitesi ölçümü için bir video görüntüleme yaklaşımı uygulanmasını hatlarıyla 13 bildirilmiştir. Biz de, video görüntüleme yaklaşım diseksiyon ve gastrointestinal doku hazırlanmasında yardımcı olmak için ayrıntılı bilgi sağlar. Buprotokol genetik fare modelleri dahil olmak üzere hastalığın hayvan modellerinde gastrointestinal fonksiyon enterik sinir kontrolünü analiz etmek için erişilebilir ve kolayca çoğaltılır aracı ile araştırmacılar sağlar.
Video görüntüleme tekniği, çeşitli farmakolojik maddeler yanıt olarak bağırsak motilitesi analiz edilmesini sağlar. İlaçlar kolon hazırlanması dış bağırsak lümeni veya organ banyosu ile uygulanabilir. Fare gastrointestinal sistemin farklı bölgeleri gibi kolonda ince bağırsak segmentasyon ve CMMCs gibi belirli hareketlilik sergilerler.
Bu teknik, küçük bağırsak fonksiyonlarında zorlanma farklılıkları tanımlamak için kullanılır olmuştur; 5-HT3 ve 5-HT4 antagonistlerinin diferansiyel duyarlılığı nedeniyle iki suş 6 olarak ifade TPH2 genin polimorfık doğası, Balb / c ve C57 / BL6 farelerinde jejunumunda gözlenmiştir. motilitesi üzerine 5-HT inhibisyonu etkisi con kalırtartışmalıdır, çelişkili veriler kolon Peristaltizmin ve CMMCs 14,15 üzerinde endojen 5-HT önemine bildirilmiştir olarak. Motilite öncesi ve doğum sonrası gelişim 7 sırasında değişiklikler ve hastalığın 10 hayvan modellerinde gastrointestinal motilite üzerindeki gen mutasyonlarının etkileri aynı zamanda video görüntüleme kullanılarak incelenebilir. Burada sinaptik yapışma proteini neuroligin-3 16 kodlayan Nlgn3 geninde yanlış anlamlı bir mutasyon ifade otizm NL3 R451C fare modelinde, kolonik motilite bir çalışma yönteminin kullanımını göstermektedir. Bu mutasyon, ilk güçlü GI disfonksiyonu 18-22 ile ilişkili Otizm spektrum bozukluğu (ASD) 17, tanısı konan hastalarda tespit edilmiştir. Biz NL3 R451C sinaptik mutasyon, video görüntüleme tekniği kullanılarak ENS nöral çıkışları etkileyip etkilemediğini araştırdık. Biz başlangıçta ve serotonerjik 5H yanıt olarak CMMCs karakterize verileri sunmakT 3/4 reseptör antagonisti tropisetron otizm NL3 R451C fare modelinde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu video görüntüleme tekniği kullanarak, CMMC frekansı vahşi tip kolonik motilite endikasyona ve NL3 R451C fareler, otizm spektrum bozukluğu 17 olan bir fare modeli olarak ölçülmüştür. Sonuçlarımız NL3 R451C farenin TROPİSETRON artan bir duyarlılık sergiler öne 5HT 3/4 reseptör antagonisti Tropisetron varlığında yabani tip farelere kıyasla mutant NL3 R451C farelerde CMMCs sayısında bir azalma göstermektedir. Bu doğrultuda, neuroligin-3 R…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB ve ELH-Y Savunma CDMRP Otizm Araştırma Programı US Department (AR11034) tarafından desteklendi. Melbourne güven ELH-Y.The Mayıs Stewart Burs-University NHMRC (1047674) MS burs finanse etti. Biz teknik katkılarından dolayı Ali Tahir, Fátima Ramalhosa ve Gracia Seger teşekkür ederiz.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Referenzen
- Powell, A. K., O’Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung’s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung’s disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung’s disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?. Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
