Creatie en transplantatie van een blad van de stamcel adipeus afkomstige (ASC) in een diabetische wondgenezing Model
Summary
Adipeus-afgeleide cellen van de stam (ASC’s) gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd en geoogst van het vet van de normale ratten. ASC bladen kunnen worden gemaakt met behulp van cellaag engineering en in Zucker vette diabetesratten exposeren full-dikte huid gebreken met blootgestelde bot en vervolgens bedekt met een dubbelgelaagde van kunstmatige huid kunnen worden getransplanteerd.
Abstract
Kunstmatige huid heeft bereikt aanzienlijke therapeutische resultaten in de klinische praktijk. Kunstmatige huid behandelingen voor wonden bij diabetische patiënten met belemmerde doorbloeding of grote wonden kunnen echter worden verlengd. Cel-gebaseerde therapieën zijn verschenen als een nieuwe techniek voor de behandeling van diabetische ulcera, en cellaag techniek is de werkzaamheid van cel transplantatie verbeterd. Een aantal verslagen hebben gesuggereerd dat adipeus afkomstige stamcellen (ASC’s), een soort mesenchymale stromale cellen (MSC), vertonen therapeutisch potentieel als gevolg van hun relatieve overvloed in vetweefsel en hun toegankelijkheid voor collectie in vergelijking met MSCs van andere weefsels. Daarom, ASC’s lijken te zijn een goede bron van stamcellen voor therapeutische doeleinden. In deze studie, werden ASC bladen van de epididymaire obesitas vet van normale Lewis ratten gemaakt met behulp van temperatuur-responsieve cultuur gerechten en normale kweekmedium dat ascorbinezuur. De bladen van ASC in Zucker diabetische vetzuren (ZDF) ratten werden getransplanteerd, een rat model van type 2 diabetes en obesitas, die vertonen verminderde wondheling. Een wond is gemaakt op de achterste craniale oppervlak, ASC bladen waren getransplanteerde in de wond en een dubbelgelaagde kunstmatige huid werd gebruikt ter dekking van de bladen. ZDF ratten die ASC bladen ontvangen had beter wondgenezing dan ZDF ratten zonder de transplantatie van ASC bladen. Deze aanpak was beperkt omdat ASC bladen gevoelig voor droge omstandigheden zijn, die het onderhoud van een vochtige wond-omgeving. Daarom, kunstmatige huid werd gebruikt ter dekking van het ASC blad om te voorkomen dat het drogen. Allogene transplantatie van ASC bladen in combinatie met kunstmatige huid kan ook gelden voor andere hardnekkige zweren of brandwonden, zoals die waargenomen met perifere arteriële ziekte en ziekte van collageen, en kan worden toegediend aan patiënten die ondervoed zijn of zijn het gebruik van steroïden. Deze behandeling zou dus de eerste stap naar verbetering van de therapeutische opties voor diabetische wond genezing.
Introduction
De bevolking van diabetische patiënten wereldwijd groeit en bereikt 400 miljoen in 20151; naar schatting 15-25% van de patiënten met diabetes zijn in gevaar van de progressie van een lagere-extremiteit diabetische Ulcus2. Lager-extremiteit diabetische ulcera zijn hardnekkig en wellicht een therapeutische langdurig met revalidatietraining na volledig herstel. Een periode van lange therapie vaak resulteert in een significante vermindering van geduldige levenskwaliteit. Nieuwe therapieën die verminderen of voorkomen van verergering moeten zo worden ontwikkeld voor de behandeling van diabetische wonden. Om te beoordelen diabetische wondgenezing, we een diabetische Ulcus wondgenezing model bij ratten, die klinische praktijkomstandigheden bootst, geoptimaliseerd en geëvalueerd of verplanten adipeus afkomstige stamcel (ASC) bladen met behulp van cellaag engineering versnelde wondheling.
Mesenchymale stromale cellen (MSCs) vertonen een uitstekende mogelijkheden om wondgenezing vanwege hun zelf-vernieuwing capaciteit, hun immunomodulerende-effecten en hun vermogen om te onderscheiden in verschillende cel lineages3te versnellen. ASC’s zijn een soort MSC afgeleid van vetweefsel, en zij vertonen verschillende voordelen ten opzichte van de MSCs afgeleid van andere weefsels, inclusief hun potentiële angiogenic en de paracrine activiteit4,5. Adipeus weefsel is relatief overvloedig in het menselijk lichaam, en de toegankelijkheid zorgt voor collectie met gebruikmaking van minimaal invasieve procedures. Daarom, ASC’s experimenteel zijn gebruikt voor wondgenezing toepassingen6,,7.
Eerdere rapporten is gebleken dat de directe injectie van eencellige MSC schorsingen in gebieden rond wonden wond genezing8,9kan versnellen. Echter, ondanks de rapporten van de versnelling van de wondgenezing in diabetische Ulcus modellen na de injectie van eencellige schorsingen, de overlevingstijd van getransplanteerde cellen op de site van de wond is niet duidelijk.
In deze studie pasten we cellaag techniek met behulp van temperatuur-responsieve cultuur gerechten. Deze gerechten zijn de temperatuur-responsieve polymeer N– isopropylacrylamide op hun oppervlakte10covalente. De geënte polymeer laag zorgt voor temperatuurgevoelig cel adhesie te of detachement van het oppervlak van de cultuur-schotel. Het oppervlak van de schotel wordt hydrofobe bij 37 ° C, waardoor cellen te houden en te verspreiden, terwijl cellen spontaan van het oppervlak, losmaken zodra het hydrofiele bij temperaturen lager dan 32 ° C. Gekweekte cellen kunnen worden geoogst als het blad van een aangrenzende cel met intact cel-naar-cel kruispunten en extracellulaire matrices (ECMs) gewoon door het verminderen van de temperatuur; Proteolytische enzymen, die schade toebrengen aan de ECM, zoals trypsine, zijn dus, niet vereist11. Daarom kan cellaag engineering cel-naar-cel verbindingen behouden en verbeteren van de doeltreffendheid van cel transplantatie.
Daarnaast verhoogt de cellaag transplantatie cel overlevingskansen vergeleken met cel injectie12. In dit protocol, Zucker vette (ZDF) diabetesratten uitgekozen als type 2 diabetes en obesitas model met vertraagde wondgenezing. Obesitas ontwikkelen ZDF ratten spontaan op ongeveer 4 weken. Vervolgens ontwikkelen ze diabetes type 2 met obesitas tussen 8 en 12 weken leeftijd, op welk punt zij vertonen hyperglycemie geassocieerd met insuline resistentie, dyslipidemia en hypertriglyceridemie13. Vertraagde wond genezing, verminderde bloedstroom in de perifere bloedvaten en diabetische nefropathie zijn ook waargenomen14,15,16. ZDF ratten zou bovendien een passende model voor het bestuderen van de genezing van hardnekkige cutane ulcera, zoals diabetische ulcera.
De verschillen tussen mensen en knaagdieren in de wond-genezing mechanismen worden geassocieerd met anatomische verschillen in de huid. Wond genezing in normale ratten is gebaseerd op de wond contractie, overwegende dat de wondgenezing bij de mens is gebaseerd op de vorming van nieuwe epithelialization en granulatie weefsel. Meestal wond spalken gebruikt in knaagdier modellen helpt bij het minimaliseren van de samentrekking van de wond en zorgt voor de geleidelijke vorming van granulatie weefsel17, hoewel wonden bij niet diabetische ratten bijna volledig door contractie gesloten zijn. Echter, diabetische wond contractie in ZDF ratten verminderde en wond genezing voornamelijk vindt plaats via re epithelialization en de vorming van de granulatie weefsel; Dus, dit proces is meer vergelijkbaar met menselijke wond genezing van14.
Diabetische wonden met blootgestelde been nadat debridement ondervindt vaak klinisch. Eerdere studies hebben onderzocht diameter 12-mm full-dikte huid wonden op de ruggen van athymic naakt muizen18,19 en diameter 10-mm full-dikte huid wonden op de ruggen van normale muizen20. Ontwikkeling van een klinische model voor ernstige diabetische wonden, grotere (15 x 10 mm2) volledig-dikte huid gebreken met blootgesteld been en zonder het beenvlies zijn gemaakt, zoals eerder beschreven21, bij ratten met type 2 diabetes en obesitas.
Rat ASC (rASC) bladen van de ASC’s van normale Lewis ratten werden gecreëerd door middel van allogene transplantatie van ASC bladen. In de klinische praktijk is autologe transplantatie onhaalbaar omdat diabetische patiënten met maagzweren vaak ernstige diabetische complicaties, zoals ongecontroleerde hoge bloedglucosespiegels en hoge lichaam massa indexen, en deze complicaties oorzaak wondgenezing aandoeningen die de moeilijkheid vertonen van het verkrijgen van adipeus weefsel van deze patiënten verhogen. Bovendien, ASC’s van dieren met diabetes tentoonstelling eigenschappen gewijzigd en verminderde functie22. Daarom wordt het protocol hier gepresenteerd beschreven allogene transplantatie van rASC sheets van normale ratten en de toepassing van kunstmatige huid op diabetische ratten.
De dubbelgelaagde kunstmatige huid gebruikt in dit protocol wordt voorkomen dat de spontane samentrekking van de wonden, bevordert de synthese van een nieuwe matrix van bindweefsel en lijkt op de echte dermis23. In dit protocol, is de kunstmatige huid geplaatst op een vel rASC en vaste met nylon draden om te voorkomen dat de wond inkrimping of uitbreiding als gevolg van losse rat huid. Bovendien, de kunstmatige huid biedt een driedimensionaal raamwerk voor de ASC-bladen, houdt van een vochtige omgeving voor de getransplanteerde ASC lakens en wonden en de wonden beschermt tegen infecties en externe krachten. Ten slotte wordt een niet-klevende dressing geplaatst over de wond te beschermen tegen externe effecten, een vochtige wond omgeving onderhouden en absorberen afgescheiden.
Een rASC vel is dun, flexibel en vervormbare en ontvangende plaatsen, zoals een kloppend hart24verplaatsen kan worden aangehouden. Cellaag techniek is gebruikt voor de wederopbouw van verschillende weefsels en annuleerteken voortbrengen genezende effecten25,26. ASC bladen die klinische therapeutisch potentieel vertonen kunnen versnellen de genezing van vele soorten wonden. Bovendien misschien allogene transplantatie van ASC bladen, gecombineerd met het gebruik van kunstmatige huid, die van toepassing zijn bij de behandeling van hardnekkige zweren of brandwonden, zoals die waargenomen bij perifere arteriële ziekte of collageen ziekte, of ze kunnen worden toegediend aan patiënten die ondervoed zijn of zijn het gebruik van steroïden. Deze aanpak verhoogt de efficiëntie van het ASC’s verplanten. De wond-genezing ZDF rat model produceert een ernstige wond aandoening die lijkt op de menselijke wond genezing proces en klinische omstandigheden in een kleine proefdieren nabootst.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor met succes het kweken van een blad rASC zijn als volgt: 1) de temperatuur moet worden gehouden bij ongeveer 37 ° C gedurende het kweken op de temperatuur-responsieve cultuur gerechten. Tijdens de creatie van een rASC blad, elke procedure werd uitgevoerd op een 37 ° C thermo-plaat, en elke reagens werd opgewarmd tot 37 ° C om te voorkomen dat de cellen spontaan loskoppelen van de schotel31. 2) de ontvangende ZDF ratten moeten worden gecontroleerd om te voorkomen d…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Yukiko Koga van het departement van de plastische en reconstructieve chirurgie, Juntendo University School of Medicine, voor het verstrekken van praktische adviezen. Wij danken ook de heer Hidekazu Murata van het centrum van Tokyo DiabetesVrouwen van medische University School of Medicine voor uitstekende technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door de oprichting van innovatie centra voor geavanceerde interdisciplinaire gebieden onderzoeksprogramma van het Project voor ontwikkelingslanden innovatiesystemen “cel blad Tissue Engineering Center (CSTEC)” van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referenzen
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. . The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
