Создание и пересадку жировой производные стволовых клеток (ASC) листа в диабетической заживление модели
Summary
Жировой производные стволовые клетки (ИСС) легко изолированы и заготавливаемым от жира нормальных крыс. ASC листы могут быть созданы с использованием клеток лист инженерии и может быть пересажены в Цукер Диабетическая жирных крыс, экспонируется полный толщина кожице с подвергаются кости и затем покрытые бислой искусственной кожи.
Abstract
Искусственной кожи добилась значительных терапевтических результатов в клинической практике. Однако искусственной кожи лечение ран у больных сахарным диабетом с затрудненного кровотока или большие раны может быть продлен. На основе клеток терапии появились как новый метод для лечения диабетической язвы, и инженерии клетки лист повысилась эффективность трансплантации клеток. Ряд докладов полагают, что жировая производные стволовых клеток (ИСС), тип мезенхимальных стромальных клеток (MSC), exhibit терапевтический потенциал благодаря их относительное изобилие в жировой ткани и их доступность для коллекции по сравнению с MSCs из других тканей. Таким образом ИСС, как представляется, быть хорошим источником стволовых клеток для терапевтического использования. В этом исследовании ASC листы из эпидидимальных жировой жира нормальной Льюис крыс были успешно созданы с помощью температуры отзывчивым культуры блюда и нормальной питательной среды, содержащих аскорбиновую кислоту. ASC листы были пересажены в Цукер Диабетическая жирные (ZDF) крысы, крысы модель типа 2 диабета и ожирения, которые демонстрируют снижение заживление ран. Рана была создана на поверхности задней черепной, ASC листы были пересажены в рану, и бислой искусственной кожи была использована для покрытия листов. ZDF крыс, которые получили ASC листы лучше ранозаживляющие чем ZDF крыс без пересадки ASC листов. Этот подход был ограничен, потому что ASC листы чувствительны к сухих условиях, требующих поддержания рану влажной обстановки. Таким образом искусственная кожа была использована для покрытия листа ASC для предотвращения высыхания. Аллогенной трансплантации ASC листов в сочетании с искусственной кожи также могут быть применимы к другим неразрешимыми язвы или ожоги, например теми, которые наблюдались с периферийные артериальные заболевания и заболевания коллагена и могут назначаться пациентам, которые страдают от недоедания или при использовании стероидов. Таким образом это лечение может быть первым шагом в направлении улучшения лечебные варианты для диабетической раны исцеления.
Introduction
Численность населения диабетических пациентов растет по всему миру и достиг 400 миллионов в 2015 году1; примерно 15-25% пациентов с диабетом подвержены прогрессирование диабетической язвы нижней конечности2. Диабетические язвы нижней конечности неразрешимыми и могут потребовать длительного терапевтического с реабилитации учебных после полного выздоровления. В течение длительной терапии часто приводит к значительным снижением качества жизни пациентов. Таким образом необходимо разработать новые методы лечения, которые уменьшить или предотвратить обострение для лечения диабетической раны. Для оценки Диабетическая заживление ран, мы оптимизировали Диабетическая язва-заживление модель крыс, которая имитирует практических клинических условиях, и оцениваются ли пересадка жировой производные стволовых клеток (ASC) листы, используя ячейку листа инженерных Ускоренное заживление ран.
Мезенхимальные стромальные клетки (Майкрософт) (MSCs) демонстрируют превосходный потенциал для ускорения заживления ран из-за их способности самообновления, их иммуномодулирующие эффекты и их способности дифференцироваться в различные ячейки линий3. ИСС типа КБМ, полученные из жировой ткани, и они обладают рядом преимуществ перед MSCs, полученных от других тканей, в том числе их ангиогенных потенциал и паракринными деятельности4,5. Жировая ткань относительно обильные в человеческом теле, и его доступность позволяет коллекции с использованием минимально инвазивных процедур. Таким образом ИСС были использованы экспериментально для заживления ран приложения6,7.
Предыдущие доклады показали, что прямого впрыска одноклеточных MSC суспензий в районах вокруг раны могут ускорить заживления ран8,9. Однако несмотря на сообщения о ускорение заживления ран в моделях диабетической язвы после инъекции одноклеточных суспензий, выживание время пересаженные клетки на месте раны не ясно.
В этом исследовании мы применили инженерных ячейки листа с помощью температуры отзывчивым культуры блюда. Эти блюда имеют ковалентно связанными на их поверхности10температура гибкой полимерной N– isopropylacrylamide. Привитые полимерный слой позволяет температуры клеточной адгезии к или отрыв от поверхности культуры блюдо. Поверхность блюдо становится гидрофобные при 37 ° C, позволяя клеток присоединиться и размножаться, тогда как клетки спонтанно отсоединить от поверхности, когда она становится гидрофильным при температурах ниже 32 ° C. Культивируемых клеток могут быть собраны как смежные ячейки листа с нетронутыми в ячейке развязок и внеклеточной матрицы (ECMs) просто путем снижения температуры; Таким образом Протеолитические ферменты, которые повреждают ECM, например трипсина, являются не требуется11. Таким образом клетки лист можно сохранять соединения к ячейке инженерно -повысить эффективность трансплантации клеток.
Кроме того трансплантации клеток лист увеличивает выживаемость клеток по сравнению с инъекции клеток12. В этом протоколе Цукер диабетической жирных крыс (ZDF) были отобраны как тип 2 диабет и ожирение модель с замедленного заживления ран. ZDF крысы спонтанно развиваться ожирения на около 4 недель. Они затем разработка диабета типа 2 с ожирением между 8 и 12 недель возраста, в какой момент они демонстрируют гипергликемии, связанные с инсулин сопротивление, дислипидемии и гипертриглицеридемия13. Замедленного заживления, снижением кровотока в периферических кровеносных сосудов и диабетической нефропатии наблюдаются14,,1516. Кроме того ZDF крысы может быть подходящей моделью для изучения исцеление неразрешимыми кожные язвы, таких как диабетические язвы.
Различия между людьми и грызунов в заживление механизмы, связанные с анатомические различия в коже. Заживления ран в нормальных крыс основана на рану сужением, тогда как заживление ран в организме человека основывается на образование грануляционной ткани и эпителизация. Как правило раны шинирование, используемые в моделях грызунов помогает свести к минимуму спад раневой и позволяет для постепенного формирования грануляционной ткани17, хотя ран в nondiabetic крысы почти полностью закрыт путем сжатия. Однако, диабетической раны сужением в ZDF крыс нарушается, и ранозаживляющее прежде всего происходит через эпителизация и образование грануляционной ткани; Таким образом этот процесс является больше похож на человека ранозаживляющее14.
Диабетической раны с подвергаются кости после того, как хирургическая часто встречаются клинически. Предыдущие исследования изучили диаметром 12-мм полная толщина кожи раны на спине Атинические мышей ню18,19 и диаметром 10-мм полная толщина кожи раны на спине обычных мышей20. Разработка клинических модели для тяжелых диабетической раны, большие дефекты полный толщина кожи (15 x 10 мм2) с подвергаются кости и без надкостницы были созданы, как описано выше21, крыс, ожирения и диабета типа 2.
Крыса ASC (РЦР) листы из ИСС нормальной Льюис крыс были созданы путем аллогенной трансплантации ASC листов. В клинической практике аутологичной трансплантации является невозможным, потому что диабетических пациентов с язвами часто exhibit тяжелых осложнений диабета, например неконтролируемым высоким глюкозы в крови и высокое тело массы индексов и эти осложнения причиной ранозаживляющим расстройств увеличивают сложность получения жировой ткани из этих пациентов. Кроме того ИСС от животных с диабетом экспонат изменены свойства и нарушениями функции22. Таким образом протокол, представленные здесь описывает аллогенной трансплантации РЦАУ листов от нормальных крыс и применение искусственной кожи для диабетической крысы.
Бислой искусственной кожи, используемые в настоящем Протоколе предотвращает спонтанное сужением РАН, способствует синтезу новой соединительной матрицы и напоминает истинный дермы23. В настоящем Протоколе искусственной кожи помещается на листе РЦУР и фиксированной с нитки капроновые предотвратить рану сжатие или расширение, вытекающие из кожи свободные крыса. Кроме того искусственной кожи обеспечивает трехмерную основу для листов ASC, поддерживает влажной среде для пересаженных ASC листов и раны и защищает раны от инфекции и внешних сил. Наконец не клей Туалетная помещается на рану, чтобы защитить его от внешнего воздействия, поддерживать рану влажной среде и поглощать экссудатом.
РЦУР листа тонкий, гибкий и деформируемых и может выполняться перемещение получателей сайтов, таких как биение сердца24. Инженерии клетки лист был использован для восстановления различных тканей и может создавать лечебные эффекты25,26. ASC листы, которые демонстрируют клинический терапевтический потенциал может ускорить заживление раны многих видов. Кроме того аллогенной трансплантации ASC листов, в сочетании с применением искусственной кожи, могут быть применимы для лечения сложных язвы или ожоги, например теми, которые наблюдались в периферийные артериальные заболевания или заболевания коллагена, или они могут назначаться пациентам, которые страдают от недоедания или при использовании стероидов. Такой подход увеличивает эффективность трансплантации ИСС. Заживление ран ZDF крысы модель производит тяжелые раны условие, что напоминает человека процесс заживления и имитирует клинических условий в малогабаритных экспериментальных животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важных шагов для успешного культивирования листа РЦАУ заключаются в следующем: 1) температура должна поддерживаться на приблизительно 37 ° C во время культивирования на блюда температуры отзывчивым культуры. В процессе создания листа РЦУР каждая процедура была выполнена на те?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктор Юкико Koga отделение пластической и реконструктивной хирургии, Juntendo школа медицины при университете, за предоставление практических рекомендаций. Мы также благодарим г-н Hidekazu Murata диабетический центр Токио женщин медицинской школы медицины университета за отличную техническую поддержку. Это исследование было поддержано создание инновационных центров для передовых междисциплинарных исследований области программы проекта для развивающихся инновационных систем «ячейки листа ткани инженерного центра (CSTEC)» от министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ) из Японии.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referenzen
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. . The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
