Criação e transplante de uma folha de células-tronco adiposo-derivado (ASC) em um modelo de cicatrização de feridas diabética
Summary
Células-tronco adiposo-derivado (ASCs) são facilmente isoladas e colhidas a partir da gordura de ratos normais. ASC as folhas podem ser criadas usando a célula-folha engenharia e podem ser transplantadas Zucker ratos diabéticos gordos, exibindo a espessura total da pele defeitos com osso exposto e então coberto com uma BICAMADA de pele artificial.
Abstract
Pele artificial tem alcançado resultados terapêuticos consideráveis na prática clínica. No entanto, tratamentos de pele artificial para feridas em pacientes diabéticos com fluxo sanguíneo impedido ou com grandes feridas podem ser prolongados. Terapias baseadas em células surgiram como uma nova técnica para o tratamento de úlceras diabéticas e célula-folha engenharia melhorou a eficácia do transplante de células. Um número de relatórios sugeriram que derivado de adiposo as células-tronco (ASCs), um tipo de células estromais mesenquimais (MSC), apresentam potencial terapêutico devido a sua abundância relativa no tecido adiposo e sua acessibilidade para coleção quando comparados com MSCs de outros tecidos. Portanto, ASCs parecem ser uma boa fonte de células-tronco para uso terapêutico. Neste estudo, folhas ASC do epidídimo gordura adiposa de ratos normais de Lewis foram criadas com êxito usando pratos de cultura temperatura-responsiva e normal meio de cultura contendo ácido ascórbico. As folhas do ASC foram transplantadas em ratos diabéticos gordos (ZDF) de Zucker, um modelo do rato de diabetes tipo 2 e obesidade, que apresentam diminuição de cicatrização. Uma ferida foi criada na superfície craniana posterior, folhas do ASC foram transplantadas para a ferida, e uma pele artificial de BICAMADA foi utilizada para cobrir as folhas. Ratos ZDF que receberam folhas ASC tinham melhor cicatrização de feridas que ratos ZDF sem o transplante de folhas ASC. Esta abordagem foi limitada porque folhas ASC são sensíveis às condições de seca, que exigem a manutenção de um ambiente de ferida húmido. Portanto, pele artificial foi usada para cobrir a folha ASC para impedir a secagem. O transplante alogênico de folhas ASC em combinação com pele artificial pode também ser aplicável a outras úlceras intratáveis ou queimaduras, tais como os observados com a doença arterial periférica e doença do colágeno e pode ser administrado a pacientes que estão desnutridos ou estiver usando esteroides. Assim, este tratamento pode ser o primeiro passo para melhorar as opções terapêuticas para diabético ferida cura.
Introduction
A população de pacientes diabéticos está aumentando em todo o mundo e chegou a 400 milhões em 20151; um estimado de 15-25% dos pacientes com diabetes estão em risco da progressão de uma úlcera diabética de extremidade inferior2. Baixo-extremidade úlceras diabéticas são intratáveis e podem exigir um período prolongado de terapêutico com treinamento de reabilitação após a completa recuperação. Um período de tempo terapia muitas vezes resulta em uma redução significativa no paciente qualidade de vida. Assim, novas terapias que diminuem ou evitar o agravamento devem ser desenvolvidas para o tratamento de feridas diabéticas. Para avaliar a cicatrização de feridas diabéticas, nós aperfeiçoamos um úlcera diabética cicatrização modelo em ratos, que imita condições práticas clínicas, e avaliada se transplante de células-tronco adiposo-derivado (ASC) folhas usando célula-folha engenharia acelerado cicatrização de feridas.
Células estromais mesenquimais (MSCs) apresentam um potencial excelente para acelerar a cicatrização de feridas por causa de sua capacidade de auto-renovação, seus efeitos imunomoduladores e sua capacidade de se diferenciar em várias linhagens de célula3. ASCs são um tipo de MSC derivada de tecido adiposo, e eles apresentam várias vantagens sobre o MSCs derivadas de outros tecidos, incluindo o seu potencial angiogênico e parácrina atividade4,5. Tecido adiposo é relativamente abundante no corpo humano, e sua acessibilidade permite coleção usando procedimentos minimamente invasivos. Portanto, ASCs foram usados experimentalmente para cicatrização da ferida aplicações6,7.
Relatórios anteriores mostraram que a injeção direta de suspensões de célula única MSC em áreas ao redor de feridas pode acelerar8,9de cicatrização de feridas. No entanto, apesar dos relatos da aceleração da cicatrização de feridas em modelos de úlcera diabética após a injeção de suspensões de célula única, o tempo de sobrevida das células transplantadas no local da ferida não é claro.
Neste estudo, aplicamos engenharia de celular-folha usando pratos de cultura temperatura-responsivo. Estes pratos têm a temperatura-responsivo polímero de N– isopropylacrylamide ligados covalentemente em sua superfície10. A camada de polímero transplantado permite aderência de célula de temperatura controlada de ou o destacamento da superfície do prato cultura. A superfície do prato se torna hidrofóbica a 37 ° C, permitindo que as células para aderir e proliferar, Considerando que as células espontaneamente desanexar da superfície quando se torna hidrofílica em temperaturas abaixo de 32 ° C. Culturas de células podem ser colhidas como uma folha de células contíguas com cruzamentos de célula para célula intactos e matrizes extracelulares (ECMs) simplesmente reduzindo a temperatura; assim, as enzimas proteolíticas que danificam o ECM, tais como a tripsina, não são necessários11. Portanto, célula-folha engenharia pode preservar ligações de celular para celular e melhorar a eficácia do transplante de células.
Além disso, transplante de células-folha aumenta as taxas de sobrevivência de células quando comparado com injeção de célula12. Neste protocolo, Zucker ratos diabéticos do gordo (ZDF) foram selecionados como um modelo de obesidade e diabetes tipo 2 com cicatrização retardada. Ratos ZDF espontaneamente desenvolvem obesidade em aproximadamente 4 semanas. Eles então desenvolver diabetes tipo 2 com obesidade entre 8 e 12 semanas de idade, altura em que eles apresentam hiperglicemia associada com insulina resistência, dislipidemia e hipertrigliceridemia13. Retardada ferida cura, redução do fluxo sanguíneo nos vasos sanguíneos periféricos e nefropatia diabética são também observadas14,15,16. Além disso, ratos ZDF podem ser um modelo adequado para estudar a cicatrização de úlceras cutâneas intratáveis, tais como úlceras diabéticas.
As diferenças entre os seres humanos e roedores em mecanismos de cicatrização de feridas são associadas com diferenças anatômicas na pele. Ferida em ratos normais de cura baseia-se na contração da ferida, Considerando que a cicatrização de feridas em humanos baseia-se na formação de tecido de granulação e re epitelização. Normalmente, ferida imobilização usado em modelos de roedores ajuda a minimizar a contração da ferida e permite a formação gradual do tecido de granulação17, apesar de feridas em ratos não-diabéticos são quase completamente fechadas pela contração. No entanto, diabético ferida contração na ZDF ratos é prejudicada, e ferida cura principalmente ocorre através de re-epitelização e a formação de tecido de granulação; assim, este processo é mais semelhante à humana ferida cura14.
Feridas diabéticas com osso exposto após desbridamento são frequentemente encontrados clinicamente. Estudos prévios examinaram, feridas de pele de espessura total de 12 mm de diâmetro nas costas do modelo camundongos18,19 e feridas de pele de espessura total de 10 mm de diâmetro nas costas dos ratos normais20. Para desenvolver um modelo clínico para feridas diabéticos graves, maiores defeitos de pele de espessura total (15 x 10 mm2) com expostos osso e sem o periósteo foram criados, como descrito anteriormente,21, em ratos com diabetes tipo 2 e obesidade.
Folhas ASC (rASC) rato das ASCs de ratos normais de Lewis foram criadas através do transplante alogênico de folhas ASC. Na prática clínica, o transplante autólogo é inviável porque pacientes diabéticos com úlceras, muitas vezes, apresentam graves complicações do diabético, como glicemia alta não controlada e os índices de massa corporal elevada e estes distúrbios cicatrização de causa complicações que aumentam a dificuldade de obtenção de tecido adiposo destes pacientes. Além disso, ASCs de animais com exposição de diabetes alteraram Propriedades e prejudicada a função22. Portanto, o protocolo aqui apresentado descreve o transplante alogênico de rASC folhas de ratos normais e a aplicação de pele artificial para ratos diabéticos.
A pele artificial de BICAMADA utilizada neste protocolo impede a contração espontânea das feridas, promove a síntese de uma nova matriz de tecido conjuntivo e assemelha-se a derme verdadeiro23. Neste protocolo, pele artificial é colocado sobre uma folha de rASC e fixado com fios de nylon para evitar a contração da ferida ou alargamento resultantes de pele de rato solto. Além disso, a pele artificial fornece uma estrutura tridimensional para as folhas ASC, mantém um ambiente úmido para o transplantado folhas ASC e feridas e protege as feridas de infecção e forças externas. Finalmente, um curativo não-adesivo é colocado sobre a ferida para protegê-lo contra impacto externo, manter um ambiente de ferida húmido e absorver o exsudato.
Uma folha de rASC é fino, flexível e deformável e pode ser aderida a mover sites destinatários, como uma batida de coração24. Célula-folha engenharia tem sido usada para a reconstrução de vários tecidos e pode gerar efeitos curativos25,26. Folhas ASC que apresentam potencial clínico terapêutico podem acelerar a cicatrização de muitos tipos de feridas. Além disso, o transplante alogênico de folhas ASC, combinado com o uso de pele artificial, pode ser aplicável para o tratamento de úlceras intratáveis ou queimaduras, tais como aquelas observadas na doença arterial periférica ou doença do colágeno, ou eles podem ser administrados a pacientes que estão desnutridos ou estiver usando esteroides. Esta abordagem aumenta a eficiência do transplante de ASCs. O modelo de rato ZDF-cicatrização produz uma condição de ferimento grave que se assemelha a ferida humana, processo de cura e imita condições clínicas em um animal experimental de pequeno porte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos para cultivo com sucesso uma folha rASC são as seguintes: 1) a temperatura deve ser mantida a aproximadamente 37 ° C durante o cultivo sobre os pratos de cultura temperatura-responsivo. Durante a criação de uma folha de rASC, cada procedimento foi realizado em um thermo-prato de 37 ° C, e cada reagente foi aquecido a 37 ° C, para impedir que as células espontaneamente desanexação do prato31. 2) os destinatários ratos ZDF devem ser monitorados para evitar a remoç…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Dr. Yukiko Koga do departamento de plástico e cirurgia reconstrutiva, Juntendo University School of Medicine, fornecendo conselhos práticos. Agradecemos também o Sr. Hidekazu Murata do centro de Tóquio diabéticas do Medical University School of Medicine para excelente suporte técnico. Este estudo foi suportado pela criação de centros de inovação para avançado programa de áreas de investigação interdisciplinar do projeto em desenvolvimento para sistemas de inovação “célula folha de tecido Engineering Center (CSTEC)” do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referenzen
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