Creazione e il trapianto di un foglio di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) in un modello diabetico di guarigione
Summary
Le cellule staminali adiposo-derivate (ASCs) sono facilmente isolate e raccolto dal grasso dei ratti normali. Fogli di ASC possono essere creati usando l’ingegneria di strato delle cellule e possono essere trapiantate in Zucker ratti grassi diabetici che esibiscono di pieno-spessore della pelle difetti con osso esposto e poi coperto con un doppio strato di pelle artificiale.
Abstract
Pelle artificiale ha raggiunto notevoli risultati terapeutici nella pratica clinica. Tuttavia, trattamenti della pelle artificiale per le ferite in pazienti diabetici con flusso sanguigno impedita o con le grandi ferite potrebbe essere prolungata. Terapie basate su cellule sono apparsi come una nuova tecnica per il trattamento delle ulcere diabetiche, e ingegneria di strato delle cellule ha migliorato l’efficacia del trapianto di cellule. Una serie di rapporti hanno suggerito che adiposo-ha derivato le cellule staminali (ASCs), un tipo di cellule stromali mesenchimali (MSC), presentano un potenziale terapeutico a causa della loro abbondanza relativa nel tessuto adiposo e loro accessibilità per raccolta rispetto al MSCs da altri tessuti. Di conseguenza, ASC sembra essere una buona fonte di cellule staminali per uso terapeutico. In questo studio, fogli ASC dal grasso adiposo dell’epididimo di ratti Lewis normali con successo sono stati creati utilizzando piastre di coltura termosensibile e normale mezzo di coltura contenente acido ascorbico. I fogli ASC sono stati trapiantati nei ratti grassi diabetici (ZDF) di Zucker, un modello del ratto del diabete di tipo 2 e dell’obesità, che presentano diminuita la guarigione delle ferite. Una ferita è stata creata sulla superficie cranica posteriore, fogli di ASC sono stati trapiantati nella ferita e una pelle artificiale doppio strato è stata usata per coprire i fogli. Ratti ZDF che hanno ricevuto fogli ASC meglio avevano delle ferite che i ratti ZDF senza il trapianto di fogli di ASC. Questo approccio è stato limitato perché ASC fogli sono sensibili alle condizioni di asciutto, che richiedono il mantenimento di un ambiente umido. Pertanto, pelle artificiale è stata usata per coprire il foglio di ASC per prevenire la secchezza. Il trapianto allogenico di fogli ASC in combinazione con pelle artificiale potrebbe anche essere applicabile ad altre ulcere intrattabili o ustioni, come quelle osservate con la malattia arteriosa periferica e la malattia del collageno e potrebbe essere somministrato a pazienti che sono denutriti o sono utilizzando gli steroidi. Così, questo trattamento potrebbe essere il primo passo per migliorare le opzioni terapeutiche per diabetico wound healing.
Introduction
La popolazione di pazienti diabetici è in aumento in tutto il mondo e ha raggiunto 400 milioni nel 20151; circa 15-25% dei pazienti con diabete sono a rischio per la progressione di un ulcera diabetica del basso-estremità2. Ulcere diabetiche del basso-estremità sono intrattabili e potrebbero richiedere un periodo terapeutico prolungato con formazione di riabilitazione dopo il recupero completo. Un periodo di lunga terapia spesso si traduce in una significativa riduzione nella qualità della vita dei pazienti. Così, nuove terapie che diminuiscono o impediscono l’aggravamento devono essere sviluppate per il trattamento delle ferite diabetiche. Per valutare la guarigione della ferita diabetica, abbiamo ottimizzato un ulcera diabetica cicatrizzazione modello in ratti, che imita condizioni cliniche pratiche, e valutate se trapianto di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) fogli utilizzando ingegneria cellulare-foglio accelerato la guarigione delle ferite.
Cellule stromali mesenchimali (MSCs) esibiscono un potenziale eccellente per accelerare la guarigione della ferita a causa della loro capacità di auto-rinnovamento, loro effetti immunomodulatori e la loro capacità di differenziarsi in vari cell lineages3. ASC sono un tipo di MSC derivate dal tessuto adiposo, ed essi presentano parecchi vantaggi sopra MSCs derivate da altri tessuti, compreso il loro potenziale angiogenico e attività paracrina4,5. Il tessuto adiposo è relativamente abbondante nel corpo umano, e sua accessibilità consente insieme utilizzando procedure minimamente invasive. Quindi, ASC sono stati usati sperimentalmente per guarigione applicazioni6,7.
Rapporti precedenti hanno indicato che l’iniezione diretta di sospensioni unicellulari MSC in aree intorno alle ferite possa accelerare la cicatrizzazione8,9. Tuttavia, nonostante i rapporti di accelerazione della guarigione delle ferite nei modelli di ulcera diabetica dopo l’iniezione di sospensioni unicellulari, il tempo di sopravvivenza delle cellule trapiantate al sito della ferita non è chiaro.
In questo studio, abbiamo applicato ingegneria cellulare-foglio utilizzando piastre di coltura termosensibile. Questi piatti hanno il polimero termosensibile N– isopropylacrylamide covalentemente sulla loro superficie10. Lo strato di polimero innestato permette per adesione a temperatura controllata o distacco dalla superficie della piastra di coltura. La superficie del piatto diventa idrofobica a 37 ° C, consentendo alle cellule di aderire e proliferare, mentre le cellule si staccano spontaneamente dalla superficie quando diventa idrofila a temperature inferiori a 32 ° C. Cellule in coltura possono essere raccolto come uno strato di cellule contigue con giunzioni cellula–cellula intatte e matrici extracellulari (ECMs) semplicemente riducendo la temperatura; così, gli enzimi proteolitici che danneggiano l’ECM, quali tripsina, non sono necessari11. Pertanto, ingegneria di strato delle cellule può preservare le connessioni cellula–cellula e migliorare l’efficacia del trapianto di cellule.
Inoltre, il trapianto delle cellule-foglio aumenta i tassi di sopravvivenza delle cellule rispetto a cella iniezione12. In questo protocollo, ratti grassi diabetici di Zucker (ZDF) sono stati selezionati come un modello di obesità e diabete di tipo 2 con ritardata guarigione delle ferite. Ratti di ZDF sviluppano spontaneamente l’obesità a circa 4 settimane. Quindi si sviluppa il diabete di tipo 2 con l’obesità tra 8 e 12 settimane di età, al punto che esibiscono l’iperglicemia associata con insulino resistenza, dislipidemia e ipertrigliceridemia13. Ritardata guarigione delle ferite, riduzione del flusso sanguigno nei vasi sanguigni periferici e della nefropatia diabetica si osservano anche14,15,16. Inoltre, ratti di ZDF potrebbero essere un modello appropriato per studiare la guarigione delle ulcere cutanee insolubile, come le ulcere diabetiche.
Le differenze tra esseri umani e roditori nei meccanismi di guarigione sono associate con differenze anatomiche nella pelle. Cicatrizzazione in ratti normali si basa sulla contrazione della ferita, mentre la guarigione arrotolata negli esseri umani è basata sulla formazione di tessuto di granulazione e riepitelizzazione. In genere, ferita splinting utilizzato nei modelli del roditore aiuta a minimizzare la contrazione della ferita e consente la graduale formazione di tessuto di granulazione17, anche se le ferite in ratti nondiabetic sono quasi completamente chiusa dalla contrazione. Tuttavia, contrazione della ferita diabetica in ZDF ratti è alterata, e principalmente la guarigione della ferita avviene attraverso la riepitelizzazione e formazione di tessuto di granulazione; così, questo processo è più simile a14di cicatrizzazione umana.
Ferite diabetiche con osso esposto dopo lo sbrigliamento sono spesso incontrate clinicamente. Precedenti studi hanno esaminato le ferite della pelle di pieno-spessore 12 mm diametro sulle spalle dei topi nudi athymic18,19 e ferite della pelle di pieno-spessore 10 mm diametro sulle spalle dei topi normali20. Per sviluppare un modello clinico per gravi ferite diabetiche, più grande (15 x 10 mm2) difetti di pelle di pieno-spessore con esposti dell’osso e senza il periostio sono stati creati, come descritto in precedenza21, in ratti con diabete di tipo 2 e l’obesità.
Fogli ASC (rASC) ratto da ASC di ratti normali di Lewis sono stati creati attraverso il trapianto allogenico di fogli di ASC. Nella pratica clinica, il trapianto autologo è impraticabile perché pazienti diabetici con ulcere spesso presentano gravi complicazioni diabetiche, quali i livelli di glucosio nel sangue alta non controllata e indici di massa corporea elevato e questi disturbi di cicatrizzazione di complicazioni causa che aumentano la difficoltà di ottenere tessuto adiposo da questi pazienti. Inoltre, ASC da animali con mostre di diabete alterata proprietà e alterata funzione22. Di conseguenza, il protocollo presentato qui descrive il trapianto allogenico di fogli rASC da ratti normali e l’applicazione della cute artificiale ai ratti diabetici.
La pelle artificiale doppio strato utilizzata nel presente protocollo impedisce la contrazione spontanea delle ferite, promuove la sintesi di una nuova matrice di tessuto connettivo e assomiglia il derma vero23. In questo protocollo, Cute artificiale viene appoggiata su un foglio di rASC e fissata con fili di nylon per impedire la contrazione della ferita o allargamento risultanti da pelle allentata del ratto. Inoltre, la pelle artificiale fornisce un quadro tridimensionale per i fogli ASC, mantiene un ambiente umido per il trapiantato ASC fogli e ferite e protegge le ferite da infezione e forze esterne. Infine, una medicazione non adesiva è posizionata sopra la ferita per proteggerlo da urti esterni, mantenere un ambiente umido e assorbire essudato.
Un foglio di rASC è sottile, flessibile e deformabile e possa essere rispettato siti destinatari, ad esempio un pestaggio cuore24in movimento. Ingegneria di strato delle cellule è stato utilizzato per la ricostruzione di vari tessuti e può generare effetti curativi25,26. Fogli ASC che presentano il potenziale terapeutico clinico potrebbero accelerare la guarigione di molti tipi di ferite. Inoltre, il trapianto allogenico di fogli ASC, combinato con l’uso della pelle artificiale, potrebbe non essere applicabile al trattamento delle ulcere intrattabili o ustioni, come quelli osservati nella malattia arteriosa periferica o malattia del collageno, o può essere somministrati a pazienti che sono denutriti o sono utilizzando gli steroidi. Questo approccio aumenta l’efficienza del trapianto ASC. Modello del ratto ZDF di guarigione della ferita produce una condizione di grave ferita che assomiglia il processo di cicatrizzazione umana e simula condizioni cliniche in un animale sperimentale di piccole dimensioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici per la coltura con successo un foglio rASC sono come segue: 1) la temperatura deve essere mantenuta a circa 37 ° C durante la coltura sui piatti di cultura termosensibile. Durante la creazione di un foglio di rASC, ogni procedura è stata effettuata su un termo-piatto di 37 ° C, e ogni reagente è stata riscaldata a 37 ° C per impedire alle cellule di spontaneamente lo scollegamento dal piatto31. 2) i ratti ZDF destinatari devono essere monitorati per impedire la rimozio…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Yukiko Koga del dipartimento di plastica e ricostruttiva, scuola di medicina dell’Università di Juntendo, per fornire consigli pratici. Ringraziamo anche il signor Hidekazu Murata del centro di Tokyo donne diabetiche di Medical University School of Medicine per l’eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato dalla creazione di centri di innovazione per avanzato programma di aree ricerca interdisciplinare del progetto per i sistemi in via di sviluppo innovativi “cella foglio Tissue Engineering Center (CSTEC)” dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referenzen
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