De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
Het kenmerk van humorale immuniteit functionele ASC, die synthetiseren en afscheiden Abs specifiek voor een antigen (Ag), zoals een pathogeen, en worden gebruikt voor afweer genereren. Voor de kwantitatieve bepaling van de functionele status van de humorale immuunrespons van het individu, zowel serum Abs en circulerende ASC worden gewoonlijk gemeten als functionele uitlezingen. Bij mensen, perifeer bloed is de meest geschikte en gemakkelijk toegankelijk monster dat kan worden gebruikt voor de bepaling van de humorale immuunrespons opgewekt door gastheer B-cellen. Afzonderlijke B-cel subsets, zoals ASC, kunnen direct worden geïsoleerd uit perifeer bloed via geselecteerde lijn-specifieke Ab-geconjugeerde microparels of via celsortering met flowcytometrie. Bovendien kunnen gezuiverde naïeve en geheugen B-cellen worden geactiveerd en gedifferentieerd in ASC in de cultuur. De functionele activiteiten van ASC bijdragen aan Ab secretie kunnen worden met ELISpot, die een test waarmee enzym convergeert-gebonden immunoabsorptiekolom assay (ELISA) en western blotting technologieën om de opsomming van individuele ASC mogelijk te maken bij de single-cell niveau. In de praktijk is de ELISPOT er steeds meer gebruik vaccineffectiviteit evalueren vanwege het gemak van het hanteren van een groot aantal bloedmonsters. De werkwijzen voor het isoleren van humane B-cellen uit perifeer bloed, zal de differentiatie van B-cellen ASC's in vitro, en de toepassing van ELISPOT voor de kwantificering van totaal IgM- en IgG-ASCs hier beschreven.
Introduction
B-cellen spelen een centrale rol bij de ontwikkeling van humorale immuniteit. Zij oorspronkelijk ontwikkeld in het beenmerg en in de bloedsomloop als naïeve B-cellen, die migreren naar lymfoïde weefsels zoals de milt, lymfeknopen, amandelen en, voor verdere ontwikkeling. Bij Ag ontmoeting, wat naïeve B-cellen migreren naar lymfoïde follikels, waar de germinal center B-cellen kunnen differentiëren in het geheugen B-cellen en plasmablasten (PBS) / plasmacellen (pc's). Terwijl de meeste PBS / PC egress in de bloedstroom, wat uiteindelijk een verblijf in het beenmerg naar terminale differentiatie ondergaan in langlevende PC 1. B-cellen in omloop zijn heterogeen, en bij steady state, PBS / pc's zijn zeldzaam in het perifere bloed 2. Door de beschikbaarheid van lijn-specifieke oppervlakte merkers, flowcytometrie is een populaire werkwijze voor de identificatie en karakterisering van de B-cel populaties in perifeer bloed. Een uitgebreide toepassing van stroom cytometry is de toevoeging van een celsorteerinrichting functie, die de scheiding en isolatie van afzonderlijke subsets van B-cellen met hoge zuiverheid mogelijk maakt. Op basis van de expressie van specifieke oppervlak receptoren in verschillende ontwikkelingsstadia, menselijke circulerende B-cellen worden in het algemeen in drie belangrijke subpopulaties ingedeeld: naïeve B-cellen (CD19 + CD27 – CD38 -), geheugen B-cellen (CD19 + CD27 + CD38 -), en PBS / pC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figuur 1). Naïeve B-cellen door de natuur nog niet tegengekomen Ags. Ze kunnen echter worden onderscheiden in IgM + CD27 + B-geheugencel. Hoewel naïeve B-cellen homogeen tot expressie B-cel antigen receptor (BCR) geassocieerde moleculen (bijvoorbeeld CD19, CD20 en CD22) zij zijn heterogeen in hun immunoglobulinerepertoire 5. De meeste CD27 + B-geheugencel kan worden onderscheiden in CD27+ / hi CD38 + PBS / pc 6. Bovendien, het geheugen B-cellen en PBS / PC's zijn polyklonaal en vertonen ontwikkelings- en functionele heterogeniteit 4-7. PBS / pc's in omloop zijn meestal van korte duur en niet uitdrukken CD138, maar die maakte om zich te vestigen in het beenmerg zal terminaal differentiëren en uitgegroeid tot een lange levensduur. Terminaal gedifferentieerde pc's uitdrukken CD138 en down-reguleren van CD27-moleculen op hun oppervlak 8. Aangezien zowel PBS en computers kunnen uitscheiden Abs zijn in veel gevallen worden ze collectief aangeduid als ASC. Daarentegen kan noch naïeve B-cellen of B-geheugencel aanzienlijke hoeveelheden Abs 9-10 produceren. Niettemin, wanneer geïsoleerd, zowel naïef en memory B-cellen kunnen worden onderscheiden in ASC in 3-10 dagen wanneer geplaatst in de juiste kweekomstandigheden 6, 11-15. In feite, ASC afgeleid van in vitro differentiatie aandeel vergelijkbaar oppervlak uitingen van CD27 en CD38 met de direct geïsoleerde frOM perifere bloed 6. Bovendien, het ASC gedifferentieerd in vitro drukken een geringe oppervlakte CD20, op elkaar dat circulerende PBS / pc 6. Hoewel de kweek afgeleide ASC's zijn korte duur, kunnen ze afscheiden Abs, wat aangeeft dat ze functioneel competent en kunnen bijdragen aan de humorale immuniteit.
Zowel ELISA en ELISPOT zijn veruit de meest toegepaste methoden waarmee functionele gegevens over de humorale immuunrespons te verkrijgen. ELISA is een 96-well-plaat gebaseerde bepaling, en wordt vaak gebruikt om de titers van serum Ag-specifieke Abs en andere analyten (bijvoorbeeld cytokines) te meten. Het is handig en schaalbaar. ELISA is ontworpen om een vaste fase enzym-assay om de aanwezigheid van Abs of andere stoffen, zoals serum te detecteren, in een vloeistofmonster 16. De uitlezingen uit serum ELISA's op grote schaal gebruikt om de immuunrespons van het lichaam representeren. Een hulpmiddel voor de verwerving van readouts van ELISA assays is een spectrofotometer microplaat reader. De lezer kan de optische dichtheid (OD) van de eindproducten typisch resulterend uit de reactie van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde detectie Abs en hun specifieke substraten 17 bepalen. Met betrekking tot het rapporteren van de humorale immuunrespons, serum levels Ab bepaald met ELISA duiden het collectief, maar geen individuele prestaties van ASC in het lichaam. Bovendien ELISA geen rekening gehouden met de bijdrage van geheugen B-cellen, die niet afscheiden Abs.
Zoals ELISA, ELISpot is een veel gebruikte werkwijze voor het detecteren en volgen van de immuunreactie in perifere bloedmonsters 17-18. ELISpot is een techniek soortgelijk aan een sandwich ELISA. Daarin worden cellen geplaatst in de polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan backed putjes van 96-putjes microplaten voor een korte termijn cultuur. De ELISPOT-test is analoog aan het uitvoeren van Western blotting op een microplaat en developing de vlekken op het PVDF membraan in elk putje. Een geautomatiseerde ELISPOT reader systeem of een stereomicroscoop voor handmatige telling vereist. Het belangrijkste voordeel van ELISPOT in het detecteren van een immuunreactie zijn uitstekende gevoeligheid in de kwantificering van ASC en cytokine-afscheidende cellen. Rapporteert de functionele activiteiten in humorale en cellulaire immuniteit, respectievelijk. In de meting van humorale immuunsysteem, zijn serum Ab niveau bepaald door ELISA en het aantal ASC erin genoemde ELISpot vaak gecorreleerd, maar de data uitlezingen uit deze twee assays hebben enkele verschillen in functionele implicaties 19-20. Het belangrijkste voordeel van ELISpot is de gevoeligheid van de methode. De serum Ab titers gerapporteerd door ELISA wordt voorgesteld semi-kwantitatief OD uitlezingen, duidt de relatieve Ab niveau of meer kwantitatief, zoals concentreren uitlezingen bij een bekende hoeveelheid van de juiste isotypen van Abs is opgenomen ter referentie. Daarentegen zijn de resultaten van ELISpot zijn presented de absolute aantal ASC in een cel pool van belang (bijvoorbeeld gefractioneerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en gezuiverde B-cellen uit PBMC). ELISpot kan een enkele ASC te detecteren, maar ELISA vereist Ab bedragen van ASC geoptimaliseerde test-afhankelijke concentraties voorafgaand aan de meting te bereiken. Daarom ELISpot is duidelijk superieur aan ELISA gevoeligheid van kwantificering. Bovendien ELISpot is ook geschikt voor het kwantificeren van de in vitro gedifferentieerde ASC van geactiveerde B-geheugencel. Geheugen B-cellen niet scheiden Abs, maar kunnen differentiëren naar ASC bij activering; ze hebben dus geen bijdrage aan serum Abs gedetecteerd door ELISA. Aldus ELISpot is de voorkeursmethode bij het meten van de immuunrespons van circulerende geheugen B-cellen na activering in kweek. Het zorgt voor de controle op de handhaving van langdurige humorale immuniteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolatie en zuivering van de humane perifere bloed B-cellen
Normaal gesproken kan RBC efficiënt worden verbroken en gewist door lysisbuffer (stap 1.2). Het is belangrijk om PBMC's met de RBC lysisbuffer langer dan 5 min incuberen, zoals levensvatbaarheid van de cellen kan worden beïnvloed door het ammoniumchloride. Als alternatief kunnen RBC en bloedplaatjes gelijktijdig worden verwijderd door het volgende protocol.
Meng vers volbloed met zuur-citraat-dextrose…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
Referenzen
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
