분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
체액 면역의 특징은 합성과 같은 병원체 항원은 (Ag), 특정 복근을 분비하고, 숙주 방어를 위해 사용되는 기능의 ASC를 생성하는 것이다. 개별의 체액 성 면역 반응의 기능적 상태의 정량, 혈청 복근 순환의 ASC는 모두 공통 기능 판독으로서 측정된다. 인간 말초 혈액 호스트 B 세포에 의해 유도 체액 성 면역 반응의 측정에 사용할 수있는 가장 편리하고 용이하게 접근 샘플이다. 의 ASC를 포함하여 고유 한 B 세포 하위 집합은, 유동 세포 계측법으로 정렬 혈통 특정 AB-접합 마이크로 비드 또는 셀을 통해 선택을 통해 말초 혈액에서 직접 분리 할 수있다. 또한, 정제 순진한 및 메모리 B 세포 활성화와 문화의 ASC로 분화 될 수있다. 구간 분비에 기여할의 ASC의 기능적 활동을 집광 효소 분석법 인 ELISPOT에 의해 정량화 될 수있다-linked immunoabsorbance 분석 (ELISA)과 웨스턴 블로 팅 기술은 단일 세포 수준에서 개인의 ASC의 열거를 활성화합니다. 실제로, ELISPOT 분석 점점 때문에 혈액 샘플을 다수의 취급 용이성 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 말초 혈에서 인간 B 세포를 분리하는 방법은 시험관 내에서의 ASC로 B 세포의 분화, 총 IgM-과의 IgG-의 ASC의 정량 ELISPOT 고용 여기에 설명 될 것이다.
Introduction
B 세포는 체액 면역의 발달에서 중요한 역할을한다. 그들은 초기 골수에서 개발 발전 용 나이브 비장으로서 림프 조직으로 이전 할 수 B 세포, 림프절, 및 편도로 혈류를 입력한다. 의 Ag 조우되면 어떤 나이브 B 세포는 배 중심 B 세포는 기억 B 세포 plasmablasts (PBS) / 혈장 세포 (PCS)로 분화 할 수 림프 여포로 이동한다. 대부분 PB들 / PC는 혈류로 송신하는 동안 거의 결국 장수의 PC (1)로 단말 분화를 거치도록 골수에 존재. 순환 B 세포는 이종이며, 정상 상태에서, PB들 / PC는 말초 혈액 2 드물다. 계통 특정 표면 마커의 사용 가능성의 결과로, 유동 세포 계측법 말초 혈액 내의 B 세포의 서브 세트의 식별 및 특성화를위한 대중적인 방법이되었다. 흐름 cytometr의 확장 응용 프로그램Y는 고순도의 분리 및 B 세포의 서브 세트 각각의 분리를 허용하는 셀 소터 기능의 추가이다. 인간 순환 B 세포는 일반적으로 세 가지 주요 부분 집단으로 분류 다양한 발달 단계에있는 특정 표면 수용체의 발현에 근거 : 기억 세포 (CD19 + CD27 + CD38 -) 나이브 B 세포 (- – CD38 CD19 + CD27) 및 PB들 / PC를 (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (그림 1). 본래 순진한 B 세포는 Ag로 발생하지 않았습니다. 그러나, 그들은 + CD27 + IgM의 기억 세포로 분화 될 수있다. 나이브 B 세포는 B 세포 항원 수용체 (BCR) -associated 분자 (예를 들어, CD19, CD20 및 CD22) 그들의 면역 레퍼토리 5 이질적 표현에서 균일하지만. CD27 + 기억 세포의 대부분은 CD27로 분화 될 수있다+ / 하이 CD38 + PB들 / PC를 6. 또한, 기억 세포 PBS를 / PC는 폴리 클로 날이고 발달 및 기능 4-7 이질성을 나타낸다. 순환 PB들 / PC는 일반적으로 수명이 짧은하고 CD138을 표현하지 않지만, 골수에 정착 만든 사람들은 말기 차별화하고 수명이 긴 될 것입니다. 말기 차별화 된 PC는 CD138을 표현하고 그 표면 8 CD27 분자를 하향 조절한다. PB들과 PC 모두 복근을 분비 할 수 있기 때문에, 많은 경우에 그들은 집합의 ASC로 표시된다. 대조적으로, 항원에 노출 된 적이없는 B 세포 나 기억 세포도 복근 9-10의 상당한 양을 생산할 수있다. 적절한 배양 조건 (6), 11-15에 위치 할 때 십일 – 절연 경우 역시, 양쪽 나이브 메모리 B 세포는 3의 ASC로 분화 될 수있다. 사실,의 ASC는 그 직접 고립 된 프랑스와 CD27과 CD38의 체외 분화 공유 유사한 표면 표현에서 파생 된톰 말초 혈액 (6). 또한, 시험관 내에서 분화의 ASC는 PB들 / 6 PC의 순환 유사한 표면 CD20의 낮은 레벨을 표현한다. 문화 유래의 ASC 모든 수명이 짧은 있지만, 그들은 기능적 능력과 체액 성 면역에 기여 할 수 있음을 나타냅니다 복근을 분비 할 수 있습니다.
지금까지와 가장 일반적으로 적용되는 방법은 체액 성 면역 반응에 대한 기능 정보를 획득하여 ELISA 및 ELISPOT 모두이다. ELISA 96 웰 플레이트 기반 분석이며, 자주 혈청 AG-특정 복근 및 기타 분석 (예, 사이토 카인)의 역가를 측정하는데 사용된다. 그것은 편리하고 확장 가능합니다. ELISA는 액체 시료 (16)에, 절대치 또는 혈청과 같은 다른 물질의 존재를 검출하기 위해 고상 효소 분석을 사용하도록 설계된다. 혈청의 ELISA를 판독 널리 신체의 면역 반응을 나타내는 데 사용되었다. 재 취득에 필요한 도구ELISA 분석에서 adouts는 분광 마이크로 플레이트 리더입니다. 독자는 일반적으로 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) – 컨쥬 게이트 검출 복근 특정 기판 (17)의 반응으로부터 생성 된 최종 생성물의 광학 밀도 (OD)를 결정할 수있다. 체액 성 면역 반응을보고와 관련하여, ELISA에 의해 결정 혈청 구간 레벨은 본문에서의 ASC의 집단했지만 개별없는 성능을 나타낸다. 또한, ELISA 계정으로 복근을 분비하지 않는 메모리 B 세포에 의해 참여를 취할 수 없습니다.
ELISA와 마찬가지로, ELISPOT은 검출 및 말초 혈액 샘플 17 ~ 18에서 면역 반응을 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법이다. ELISPOT는 샌드위치 ELISA에 관한 기술이다. 그것에서, 세포는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 단기 배양 용 96 웰 마이크로 플레이트의 막 역행 웰에 배치된다. ELISPOT 분석은 마이크로 및 developin에 웨스턴 블로 팅을 수행하는 유사g 각 웰의 PVDF 막에있는 관광 명소입니다. 자동화 ELISPOT 리더 시스템 또는 수동 계산을위한 실체 현미경이 필요합니다. 면역 반응을 검출 ELISPOT에서의 가장 큰 장점의 ASC 및 사이토 카인을 분비하는 세포의 정량화는 뛰어난 감도이다. 그것은 각각 체액 성 및 세포 성 면역에 기능적 활동을보고합니다. 체액 성 면역 기능의 측정에는, ELISA 및 ELISPOT 열거의 ASC의 수에 의해 결정 혈청 구간 레벨들은 상관되어 있지만, 이들 두 분석으로부터의 데이터 판독 기능은 영향 19-20에서 약간의 차이가있다. ELISPOT의 가장 큰 장점은 방법의 감도입니다. 복근의 적절한 이소 타입의 알려진 양이 참조 용으로 포함되고 ELISA에 의해보고 된 혈청 구간 역가 수준 농도 판독으로 더 정량적으로 상대 구간 레벨을 나타내는, OD 판독으로 반 정량적으로 제시하거나한다. 반대로, ELISPOT의 결과이다 presente관심의 세포 풀의 ASC의 절대 수와 D (예를 들어, 분획 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 한 PBMC로부터 정제 된 B 세포). ELISPOT은 하나의 ASC를 감지 할 수 있지만, ELISA 전에 측정에 최적화 된 분석에 의존하는 농도에 도달의 ASC에서 Ab의 금액이 필요합니다. 따라서, ELISPOT은 정량 감도 ELISA에 분명 우수하다. 또한, ELISPOT은 활성화 기억 세포의 체외 분화의 ASC 정량화에 적합하다. 메모리 B 세포는 복근을 분비하지 않지만 활성화시의 ASC로 분화 할 수 있습니다; 그들은 따라서 ELISA에 의해 검출 된 혈청 복근에 기여가 없습니다. 따라서, ELISPOT 배양에서 활성화 후 기억 세포 순환의 면역 반응의 측정에있어서 선택의 방법이다. 이는 장기 체액 면역의 유지의 모니터링을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화
일반적으로 적혈구 효율적으로 파열 및 용해 버퍼 (단계 1.2)에 의해 삭제 될 수 있습니다. 세포 생존율은 염화 암모늄에 의해 영향을받을 수 있습니다로는 5 분 이상 더 이상 RBC 용해 버퍼 PBMC를 품어하지 않는 것이 중요합니다. 대안 적으로, 적혈구 및 혈소판 동시에 다음의 프로토콜에 의해 제거 될 수있다.
산 스트…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
Referenzen
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