El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
El sello distintivo de la inmunidad humoral es generar ASCs funcionales, que sintetizan y secretan Abs específica a un antígeno (Ag), tal como un patógeno, y se utilizan para la defensa del huésped. Para la determinación cuantitativa del estado funcional de la respuesta inmune humoral de un individuo, tanto Abs suero y ASC circulantes se miden comúnmente como lecturas funcionales. En los seres humanos, la sangre periférica es la muestra más conveniente y fácilmente accesible que se puede utilizar para la determinación de la respuesta inmune humoral provocada por células B de acogida. subconjuntos de células B distintos, incluyendo ASC, se pueden aislar directamente a partir de sangre periférica a través de la selección con microperlas Ab-conjugados específicos de linaje o mediante clasificación de células con citometría de flujo. Además, las células B vírgenes y de memoria purificadas se pueden activar y diferenciar en ASCs en cultivo. Las actividades funcionales de ASC para contribuir a la secreción de Ab se pueden cuantificar por ELISpot, que es un ensayo que converge enzima-vinculada ensayo de inmunoabsorbancia (ELISA) y tecnologías de Western Blot para permitir la enumeración de las ASC individuales a nivel de una sola célula. En la práctica, el ensayo ELISPOT se ha utilizado cada vez más para evaluar la eficacia de la vacuna debido a la facilidad de manejo de un gran número de muestras de sangre. Los métodos de aislamiento de células B humanas de sangre periférica, se describirán aquí la diferenciación de células B en ASCs in vitro, y el empleo de ELISpot para la cuantificación del total de IgM e IgG-ASC.
Introduction
las células B juegan un papel central en el desarrollo de la inmunidad humoral. En un principio se desarrollan en la médula ósea y entran en el torrente sanguíneo como ingenuo células B, que pueden migrar hacia los tejidos linfoides, tales como el bazo, los ganglios linfáticos, las amígdalas, para un mayor desarrollo. Al Ag encuentro, algunas células B vírgenes migran hacia los folículos linfoides, donde los centros germinales células B pueden diferenciarse en células B de memoria y plasmablastos (PBS) / células plasmáticas (PC). Aunque la mayoría de PBS / PCs de salida en la corriente de la sangre, unos pocos, finalmente, residen en la médula ósea para experimentar diferenciación terminal en PCs de larga vida 1. Las células B en circulación son heterogéneas, y en el estado estacionario, PBS / PC son raros en la sangre periférica 2. Como resultado de la disponibilidad de marcadores de superficie específicos de linaje, citometría de flujo se ha convertido en un método popular para la identificación y caracterización de los subconjuntos de células B en sangre periférica. Una aplicación extendida de flujo cytometry es la adición de una función de clasificación de células, lo que permite la separación y el aislamiento de subconjuntos individuales de células B con una alta pureza. Sobre la base de la expresión de receptores de superficie específicos en diferentes etapas de desarrollo, las células B circulantes humanos se clasifican generalmente en tres subpoblaciones principales: células B vírgenes (CD19 + CD27 – CD38 -), las células B de memoria (CD19 + CD27 + CD38 -), y PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figura 1). células B vírgenes, por naturaleza, no se han encontrado con Ags. Sin embargo, pueden ser diferenciadas en células IgM + CD27 + B de memoria. Aunque las células B vírgenes son homogéneos en la expresión del receptor de antígeno de células B (BCR) -asociado moléculas (por ejemplo, CD19, CD20 y CD22) que son heterogéneos en su repertorio de inmunoglobulina 5. La mayoría de las células CD27 + B de memoria se puede diferenciar en CD27+ / CD38 + hi PBS / PC 6. Además, las células B de memoria y PBS / PCs son policlonales y exhiben heterogeneidad desarrollo y funcional 4-7. PBS / PC en la circulación son normalmente de corta duración y no expresan CD138, pero los realizados para establecerse en la médula ósea se terminalmente diferenciarse y convertirse larga vida. Terminalmente diferenciadas PC expresan CD138 y regulan por disminución moléculas CD27 en su superficie 8. Dado que tanto el PBS y PCs son capaces de secretar Abs, en muchas ocasiones se designan colectivamente como ASC. En cambio, ni las células B vírgenes ni las células B de memoria pueden producir cantidades apreciables de Abs 9-10. Sin embargo, cuando se aíslan, tanto las células B vírgenes y de memoria pueden diferenciarse en ASCs en 3 – 10 días cuando se coloca en las condiciones de cultivo apropiadas 6, 11-15. De hecho, las ASC derivadas de la diferenciación in vitro de acciones expresiones similares en la superficie de CD27 y CD38 con los fr aislados directamentesangre periférica om 6. Además, las ASC diferenciadas in vitro expresan un bajo nivel de CD20 de superficie, similar al de circulación de PBS / PCs 6. A pesar de las ASC derivados de cultivos de todo son de corta duración, que pueden secretar Abs, indicando que son funcionalmente competente y capaz de contribuir a la inmunidad humoral.
Ambos ELISA y ELISPOT son con mucho los métodos más comúnmente aplicado con los que obtener información funcional sobre la respuesta inmune humoral. ELISA es un ensayo basado en placa de 96 pocillos, y se utiliza frecuentemente para medir los títulos de Abs Ag-específica suero y otros analitos (por ejemplo, citoquinas). Es conveniente y escalable. ELISA está diseñado para utilizar un ensayo enzimático en fase sólida para detectar la presencia de ABS o de otras sustancias, tales como suero, en una muestra líquida 16. Las lecturas de ELISA en suero han sido ampliamente utilizados para representar la respuesta inmune del cuerpo. Una herramienta necesaria para la adquisición de la readouts de ensayos ELISA es un lector de microplacas espectrofotométrico. El lector puede determinar la densidad óptica (OD) de los productos finales típicamente resultantes de la reacción de la peroxidasa de rábano picante (HRP) Abs detección conjugado y sus sustratos específicos 17. Con respecto a la información de la respuesta inmune humoral, los niveles de suero AB determinados por ELISA denotan el colectivo, pero no individual, el rendimiento de ASC en el cuerpo. Además, ELISA no tiene en cuenta la participación de las células B de memoria, que no secretan Abs.
Como ELISA, ELISPOT es un método ampliamente utilizado para la detección y el seguimiento de la respuesta inmune en muestras de sangre periférica 17-18. ELISpot es una técnica relacionada con un sándwich ELISA. En ella, las células se colocan en el difluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana pozos con respaldo de microplacas de 96 pocillos para un cultivo a corto plazo. El ensayo ELISPOT es análoga a la realización de Western Blot en una microplaca y developing las manchas en la membrana de PVDF en cada pocillo. Se requiere un sistema lector de ELISPOT automatizado o un estereomicroscopio para el recuento manual. La principal ventaja de ELISPOT en la detección de una respuesta inmune es su excelente sensibilidad en la cuantificación de las ASC y células secretoras de citocinas. Se informa de sus actividades funcionales en la inmunidad humoral y celular, respectivamente. En la medición de la función inmune humoral, los niveles de suero AB determinados por ELISA y el número de ASC enumerados por ELISPOT son a menudo correlacionados, pero las lecturas de datos de estos dos ensayos tienen algunas diferencias en implicaciones funcionales 19-20. La principal ventaja de ELISpot es su sensibilidad de método. El nivel de los títulos de suero AB según lo informado por ELISA se presenta semi-cuantitativamente como lecturas de DO, que indica el nivel de Ab relativa, o más cuantitativamente, como las lecturas de concentración cuando se incluye una cantidad conocida de los isotipos apropiados de Abs para referencia. En contraste, los resultados de ELISPOT son Presented como el número absoluto de ASC en una piscina de célula de interés (por ejemplo, células no fraccionadas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y células B purificadas de PBMCs). ELISpot puede detectar una sola ASC, pero ELISA requiere cantidades Ab de ASC para llegar a concentraciones de ensayo dependiente optimizados antes de la medición. Por lo tanto, ELISpot es obviamente superior a ELISA en la sensibilidad de la cuantificación. Por otra parte, ELISpot también es adecuado para la cuantificación de las ASC diferenciadas in vitro a partir de células B de memoria activados. células B de memoria no secretan Abs, pero pueden diferenciarse en ASC tras la activación; por lo tanto no tienen ninguna contribución a Abs suero detectados por ELISA. Por lo tanto, ELISpot es el método de elección en la medición de la respuesta inmune de las células B de memoria que circula después de la activación en cultivo. Permite la supervisión del mantenimiento de la inmunidad humoral a largo plazo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aislamiento y la purificación de células B de sangre periférica humana
Normalmente, los glóbulos rojos se pueden romper de manera eficiente y borrar por tampón de lisis (paso 1.2). Es importante no incubar PBMCs con el tampón de lisis RBC más de 5 min, como la viabilidad celular puede verse afectado por el cloruro de amonio. Alternativamente, los glóbulos rojos y las plaquetas se pueden eliminar simultáneamente por el siguiente protocolo.
Mezclar la sang…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
Referenzen
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
