単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
体液性免疫の特徴は、合成し、そのような病原体としての抗原（Ag）から、固有の腹筋を分泌し、宿主防御のために使用される機能のASCを、生成することです。個体の体液性免疫応答の機能状態を定量的に決意するために、血清のAb及び循環のASCの両方は、一般的に機能的な読み出しとして測定されます。ヒトにおいては、末梢血は、宿主B細胞によって誘発される体液性免疫応答を決意するために使用することができる最も便利で容易にアクセス可能な試料です。 ASCを含む異なるB細胞サブセットは、系統特異的抗体コンジュゲートビーズまたはフローサイトメトリーで細胞選別を介して選択を介して、末梢血から直接単離することができます。また、精製されたナイーブ及びメモリーB細胞を活性化し、培養中のASCに分化させることができます。抗体分泌に貢献するのASCの機能活性は、酵素を収束するアッセイであるエリスポットによって定量することができます- 結合immunoabsorbanceアッセイ（ELISA）およびウエスタンブロッティング技術は、単一細胞レベルでの個々のASCの列挙を有効にします。実際には、ELISpotアッセイは、ますますために血液試料の多数の取り扱いの容易さのワクチンの有効性を評価するために使用されています。末梢血からのヒトB細胞を単離する方法は、 インビトロでのASCへのB細胞の分化、および総IgM-およびIgG-ASCを定量化するためのELISpotの使用は、ここで説明します。
Introduction
B細胞は、体液性免疫の発達において中心的な役割を果たしています。彼らは当初、骨髄で開発し、さらなる発展のために、ナイーブ脾臓などのリンパ組織へと移動することができるB細胞、リンパ節、および扁桃として血流を入力してください。銀遭遇すると、いくつかのナイーブB細胞が胚中心B細胞は、記憶B細胞および形質（PBS）/プラズマ細胞（パソコン）に分化することができるリンパ濾胞へ移行します。ほとんどのPB / PCが血流に発信されているが、いくつかは、最終的には長寿命のパソコン1に最終的に分化するために骨髄に存在します。循環中のB細胞は不均一であり、かつ定常状態で、PBS / PCは、末梢血2で稀です。系統特異的表面マーカーの利用可能性の結果として、フローサイトメトリー末梢血中のB細胞サブセットの同定および特徴付けのための一般的な方法となっています。フローcytometrの拡張アプリケーションYは、高純度で分離し、B細胞の個々のサブセットの単離を可能にするセルソーター機能の追加です。異なる発生段階の特定の表面受容体の発現に基づいて、人間の循環B細胞は一般的に3つの主要な亜集団に分類される、記憶B細胞（CD19 + CD27 + CD38 – ）、ナイーブB細胞（ – – CD38 CD19 + CD27）、およびPBS /パソコン（CD19 + CD27 + CD38 +）3-4（ 図1）。本質的にナイーブB細胞はのAgに遭遇していません。しかし、それらはIgM抗体+ CD27 +メモリーB細胞に分化することができます。ナイーブB細胞（BCR）関連分子（ 例えば、CD19、CD20およびCD22）、B細胞抗原受容体を発現に均質であるが、それらは、免疫グロブリンレパートリー5に不均質です。 CD27 +メモリーB細胞の大部分はCD27に分化することができます+ /ハイCD38 + PBS /パソコン6。また、メモリーB細胞およびPBS / PCはポリクローナルであり、発達および機能異質4-7を示します。循環中のPB / PCは、通常短命であり、CD138を発現しないが、骨髄に落ち着くために作られたものは、末端分化し、長寿命となります。最終的に分化したPCは、CD138を発現し、その表面8上にCD27分子をダウンレギュレートします。 PBSおよびPCの両方が腹筋を分泌することができるので、多くの場面では、それらを総称したASCと表記されています。対照的に、ナイーブB細胞や記憶B細胞のいずれもは、ABS 9-10のかなりの量を生成することができます。適切な培養条件6、11-15に置かれたとき、10日-単離された場合、それにもかかわらず、両方のナイーブ及びメモリーB細胞は、3でのASCに分化させることができます。実際には、ASCを、それらの直接分離されたFRとCD27とCD38のインビトロ分化を共有同様の表面式から導出しますオム末梢血6。また、in vitroで分化したASCは、PBS /パソコン6の循環同様の表面CD20の低レベルを発現します。文化由来のASCは、すべての短命ですが、彼らは機能的に有能で、体液性免疫に貢献することが可能であることを示す、ABS樹脂を分泌することができます。
遠くで最も一般的に適用される方法は、体液性免疫応答の機能情報を取得することにより、ELISAおよびエリスポットの両方があります。 ELISAは、96ウェルプレートに基づくアッセイであり、しばしば血清Ag特異ABSおよび他の検体（ 例えば、サイトカイン）の力価を測定するために使用されます。これは、便利かつスケーラブルです。 ELISAは、液体試料16中、ABS又は血清のような他の物質の存在を検出するための固相酵素アッセイを使用するように設計されています。血清のELISAからの読み出しが広く体の免疫応答を表すために使用されてきました。再取得のために必要なツールELISAアッセイからadoutsは、分光光度マイクロプレートリーダーです。リーダは、典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）共役検出ABSおよびその特異的な基質17の反応から得られる最終生成物の光学密度（OD）を決定することができます。体液性免疫応答の報告に関して、ELISAによって決定した血清抗体レベルは、体内でのASCの集団ではなく、個々の性能を示します。また、ELISAは、アカウントに腹筋を分泌しない記憶B細胞による参加を取ることができません。
ELISAのように、エリスポットは、末梢血サンプル17-18で免疫応答を検出し、監視するための広く用いられている方法です。 ELISpotは、サンドイッチELISAに関連する技術です。その中で、細胞をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）短期培養のためのマイクロプレートの96ウェルの膜・バックウェルに配置されています。 ELISpotアッセイは、マイクロプレートとdevelopinにウェスタンブロッティングを行うに類似していますグラム各ウェルのPVDF膜上のスポット。自動ELISPOTリーダーシステムやマニュアルの計数のための実体顕微鏡が必要です。免疫応答を検出するのELISpotの主な利点は、ASCにおよびサイトカイン分泌細胞の定量化におけるその優れた感度です。それは、それぞれ、体液性および細胞性免疫におけるそれらの機能の活動を報告します。体液性免疫機能の測定では、ELISAおよびELISPOTによって列挙されたASCの数によって決定される血清抗体レベルは、しばしば相関しているが、これらの2つのアッセイからのデータ読み出しは、機能的意味19-20でいくつかの違いがあります。エリスポットの主な利点は、この方法の感度です。 Abの適切なアイソタイプの既知量を参考のために含まれている場合に、ELISAによって報告されているように、血清抗体力価のレベルは、濃度の読み出しとして、より定量的に相対的な抗体のレベルを示す、ODの読み出しとして半定量的に提示、またはされています。対照的に、のELISpotの結果はpresenteあります関心対象の細胞プールでのASCの絶対数としてD（ 例えば、未分画の末梢血単核細胞（PBMC）及びPBMCから精製したB細胞）。エリスポットは、単一のASCを検出することができますが、ELISAは、測定前に最適化されたアッセイに依存する濃度に到達するのASCからのAbの量を必要とします。したがって、エリスポットは、定量化の感度のELISAに明らかに優れています。また、エリスポットはまた、活性化された記憶B細胞のインビトロ分化のASCを定量化するのに適しています。記憶B細胞は、ABSを分泌しないが、活性化の際のASCに分化することができます。彼らは、したがって、ELISAによって検出された血清のAbsへの貢献を持っていません。従って、エリスポットは、培養中の活性化した後、記憶B細胞の循環の免疫応答の測定で選択する方法です。これは、長期的な体液性免疫の維持の監視を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト末梢血B細胞の単離および精製
通常、RBCが効率的に破裂し、溶解バッファー（ステップ1.2）でクリアすることができます。細胞生存率は、塩化アンモニウムによって影響を受ける可能性があるように、5分より長いRBC溶解緩衝液でのPBMCをインキュベートしないことが重要です。また、赤血球と血小板は同時に以下のプロトコルによって除去することができます。
<p clas…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
Referenzen
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