يعيش التصوير خلية وتحليل 3D من أنجيوتنسين مستقبلات نوع 1A الاتجار في خلايا الكلى Transfected الجنينية البشرية عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر
Summary
هنا نقدم بروتوكول لخلايا صورة تعبر عن الأخضر الفلورسنت نوع أنجيوتنسين مستقبلات 1A الموسومة البروتين خلال الإلتقام التي بدأها العلاج أنجيوتنسين الثاني. وتتضمن هذه التقنية الجسيمات الحالة وضع العلامات مع علامة فلوري الثانية، ومن ثم استخدام برنامج لتحليل شارك في توطين مستقبلات ويحلول في ثلاثة أبعاد على مر الزمن.
Abstract
يستخدم التصوير الخلية الحية لالتقاط الصور في وقت واحد في الوقت الفاصل بين مستقبلات الأنجيوتنسين نوع 1A (AT 1A R) ومقصورات داخل الخلايا في الخلايا الجنينية البشرية transfected الكلى 293 (كلوة) بعد التحفيز مع أنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني). و transfected خلايا كلوة عابر مع DNA البلازميد التي تحتوي على AT 1A R ذات الكلمات الدلالية مع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP). يتم تحديد الجسيمات الحالة مع صبغ أحمر فلوري. يتم التقاط الصور الخلية الحية على المجهر متحد البؤر المسح بالليزر بعد التحفيز انج الثاني وتحليلها من قبل البرامج في ثلاثة أبعاد (3D، voxels) مع مرور الوقت. التصوير الخلية الحية يمكن التحقيقات في الاتجار مستقبلات ويتجنب يفند المرتبطة التثبيت، وعلى وجه الخصوص، وفقدان أو النزوح مصطنع من مستقبلات الغشاء EGFP الموسومة. وهكذا، كما يتم تعقب الخلايا الفردية عبر الزمن، وتوطين التحت خلوية من المستقبلات يمكن تصوير وقياس. يجب الحصول على الصور ذلك كافياذ بسرعة لالتقاط الحركة السريعة حويصلة. ومع ذلك، وبسرعة التصوير أسرع، وتخفيض عدد الفوتونات التي تم جمعها. يجب أيضا أن تكون التنازلات في اختيار المعلمات التصوير مثل حجم فوكسل من أجل الحصول على سرعة التصوير. تطبيقات كبيرة من التصوير الخلية الحية هي لدراسة الاتجار البروتين، والهجرة، والانتشار، دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، الالتهام الذاتي والبروتين البروتين التفاعل وديناميكية، على سبيل المثال لا الحصر.
Introduction
ويتمثل الهدف العام للحصول على أدلة الكمي في الزمان والمكان من colocalization مستقبلات مع العضيات التحت خلوية محددة بعد العلاج مع ناهض مستقبلات. وهكذا، فإن الهدف المباشر هنا هو لالتقاط الوقت الفاصل بين الصور مبائر من الجسيمات الحالة والغشاء الذي يمتد مستقبلات في خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة) بعد ترنسفكأيشن وبعد ذلك تجميع وتحليل البيانات التصوير في 3D لقياس كمي لتسليم مستقبلات ل الجسيمات المحللة. التحقيق في الاتجار وقت واحد من مستقبلات الغشاء مع الجسيمات الحالة أو العضيات الأخرى خلال الإلتقام عندما تفعيلها من خلال يجند مستقبلات يمكن أن تساعد في تحديد كيفية تنظيم مستقبلات الغشاء في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.
AT 1A يفترض R أن تتحلل في الجسيمات الحالة بعد العلاج مع انج الثاني في أنظمة خلايا نموذج، في المقام الأول HEK293 1 على الرغم من أن غالبية تفصيليتم ترجمة eptors في المقام الأول في الإندوسومات إعادة التدوير عديد الحويصلات لإعادة التدوير في وقت لاحق إلى غشاء البلازما في حين أن الجزء الأكبر من يجند، آنغ الثاني، هو المتدهورة في يحلول 2، 3، 4، 5. وفي الآونة الأخيرة، لي وآخرون. أظهرت باستخدام نقل فورستر للطاقة الرنين (الحنق) وتقنيات مضان المجهر العمر التصوير (FLIM) أن colocalizes AT 1A R (على ~ 10 نانومتر نطاق) مع LAMP1، وهو بروتين غشاء الليزوزومية مما يشير إلى أن ما لا يقل عن بعض من مستقبلات المستهدفة إلى والمتدهورة من الجسيمات الحالة 6. ولاحظ هؤلاء الكتاب أن الكلوروكين الليزوزومية المانع سدت في 1A جمعية R-LAMP1 وهو ما يتسق مع التقارير السابقة تشير إلى أن تأثير الكلوروكين هو لمنع انصهار أواخر الإندوسومات أو autophagosomes مع الجسيمات الحالة. النهج غير المباشرة الأخرى لتحديد AT 1A R لوقد استخدمت ocalization في الجسيمات الحالة bafilomycin، مثبط الليزوزومية أن نستنتج AT جود R 1A في الجسيمات الحالة 3، 4، 5، 6، 7، 8.
التصوير الخلية الحية يتجنب الآثار المحتملة للتثبيت على حجم الخلية، وفقدان / يعتم / إعادة توزيع مستقبلات GFP خيالية. وقد اعتمدت الدراسات السابقة على خلايا ثابتة لتحديد colocalization أو توارد من مستقبلات مع الجسيمات الحالة أو باستخدام الخلايا الحية المسمى مع بدائل ملزمة مستقبلات مثل β arrestin 1، 2، 3، 4، 5، 6. التصوير الخلية الحية من GPCRs أخرى باستخدام متحد البؤر القرص الغزل أو ليزر نقطة المسح أسيوطالمجاهر OCAL مجهزة GaASP أو HYD كشف عن مكنت المحققين لمراقبة داخليا والاتجار بها المستقبلات في الخلايا الفردية تصويرها في زي مداخن في 30 ثانية فترات 9 و 10. ولكن حتى عندما يتم جمع الحية خلية ض مداخن بسرعة، قد تحدث التحليل إلا بعد اختيار طائرة واحدة في كل كومة، أي في 2D 10. في حين أن هذا قد يكون كافيا لدراسة المنضوية النوع من الاختزال أو التيروزين كيناز مستقبلات في مسألة ما، و1A روبية AT تتراكم في الحويصلات التي تغير حجم وموضع على مر الزمن، وبالتالي فهي بطبيعتها أكثر صعوبة لعينة كاف باستخدام شريحة واحدة تمثيلية في كل نقطة زمنية. لتحديد دقيق لمسار المسمى AT 1A R من خلال الخلية وللكشف عن كل من السكان من الحويصلات اختلاف في حجم وموضع، فقد تم تطوير هذا الأسلوب للتصوير 3D وتحليل 3D لتتبع هذه التغييرات وأن يكون تستخدم جنبا إلى جنب مع وضع العلامات من مختلف حجرات داخل الخلايا مثل الجسيمات الحالة.
يمكن للمحققين استخدام هذا البروتوكول للتصوير الخلايا الحية لتصور مباشرة حركة AT 1A R في الخلية ونقلها إلى مقصورات التحت خلوية بعد التحفيز انج الثاني. يتم تمييزها المقصورات التحت خلوية مع الوهم بروتين فلوري أو علامات الفلورسنت الأخرى. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول أن تستخدم النهج الأول في توطين المستقبلات في العضيات التحت خلوية مع الحد الادنى من القرار 200 نانومتر من أجل مقارنة تحور مقابل من النوع البري مستقبلات أو للكشف عن التغييرات التالية العلاجات الدوائية. هذه التقنية يمكن الوصول إليها نظرا لأنه يمكن القيام بها في أي المجهر متحد البؤر مجهزة للتصوير الخلايا الحية. السهولة النسبية لهذا النهج يتناقض مع زيادة الخبرة والمعدات اللازمة لتنفيذ الحنق FLIM تقنيات / / BRET الذي كشف عن التفاعلات الجزيئية 6،"XREF"> 11. هذه القياسات تحدد تفاعلات البروتين البروتين بدقة عالية (~ 10 نانومتر) ويستدل توطين داخل عضيات التحت خلوية. وتستخدم هذه التقنيات المتقدمة لمتابعة وزيادة تحديد التفاعلات الجزيئية المصالح، بدلا من المرور من المستقبلات من خلال المقصورات التحت خلوية، وأنها تظهر مباشرة تفاعلات البروتين البروتين في أوقات وأماكن محددة داخل الخلية 11. FLIM، وهي تقنية الحنق مستقلة التركيز متقبل، وغالبا ما تجرى على عينات ثابتة منذ الحصول على الصور أبطأ. في المقابل، يوفر نسبة الحنق التصوير السريع وقرار colocalization عالية من البروتينات التفاعل. العيب من نسبة الحنق هو أن التصوير يستخدم widefield برنامج التحصين الموسع ومضان للحصول على سرعة التصوير وتشمل الخلية بأكملها، مما أدى إلى انخفاض القرار، وعلى النقيض من العضيات 12. نقل تلألؤ بيولوجي الطاقة الرنين (BRET) هو آخرتقنية المتقدمة التي تم تطبيقها على GPCRs لقياس اكتساب القرب الجزيئي على مر الزمن 11. في هذه التقنية يتم تقسيم fluorophore البروتين جزيئيا ويرتبط كل منهما نصف إلى واحد من اثنين من البروتينات في السؤال. عندما اثنين من البروتينات من ربط الفائدة بعضها البعض، وأجزاء من العلامة خيالية تعيد تجميع للحصول على مضان وزيادة مضان كميا مع مرور الوقت.
هنا، نقدم تقنية واضحة للتصوير الخلايا الحية إلى جانب الكمي الصورة لدراسة الاتجار AT 1A R في الخلية على التحفيز انج الثاني وتغيير محتمل في تسليم المنضوية AT 1A R لالجسيمات الحالة التالية انج الثاني التحفيز. الاستخدام النهائي لهذه التقنية هو لوصف الاختلافات في الاتجار غشاء مقارنة نوع البرية ومستقبلات تحور. وهذه الاختلافات تساعد على تحديد آلية (ق) التي تؤثر الأنشطة الفسيولوجية للAT 1A R leadiنانوغرام لتنظيم ضغط الدم.
Protocol
Representative Results
Discussion
التجارب الأولية المقدمة هنا توضح أن أكثر من دورة زمنية قصيرة بدلا من 24 دقيقة، لم يطرأ أي تغيير ملموس في تسليم AT 1A R-GFP إلى الجسيمات الحالة. بشكل عام، يمكن أن يحدث تسليم مستقبلات المنضوية في الجسيمات الحالة في وقت مبكر من 15-20 دقيقة. هذه التجربة هي متسقة مع فرضية ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد العمل البحوث التي قدمت في هذه المخطوطة من قبل منحة R01 HL121456-01A1 إلى كاثرين ساندبرج. وأيد هذا العمل بالإضافة إلى توافر لايكا SP8 AOBS في الميكروسكوب والموارد المشتركة تصوير (مصر) في المركز الطبي بجامعة جورج تاون الذي يتم تمويله جزئيا من قبل P30-CA051008 من المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية. نحن نعترف بامتنان لايكا المساعدة SP8 التصوير بيتر جونسون، واستخدام زايس LSM880 في مختبر توماس Coate، قسم علم الأحياء في جامعة جورج تاون بمساعدة التصوير التي تقدمها ألما أرنولد من كارل زايس المجهر LLC. هذا المحتوى من المخطوط هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Referenzen
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
