Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie
Summary
Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.
Abstract
Levende cellen beeldvorming wordt gebruikt om gelijktijdig vastleggen time-lapse beelden type 1a angiotensine receptoren (AT 1a R) en intracellulaire compartimenten in getransfecteerde humane embryonale nier-293 (HEK) cellen na stimulatie met angiotensine II (Ang II). HEK cellen tijdelijk getransfecteerd met plasmide DNA dat op 1a R tag versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP). Lysosomen worden geïdentificeerd met een rode fluorescerende kleurstof. Levende cellen beelden worden vastgelegd op een laser scanning confocale microscoop na Ang II stimulatie en software geanalyseerd in drie dimensies (3D voxels) tijd. Live-cell imaging maakt onderzoek naar receptoren handel en vermijdt verwart geassocieerd met fixatie, en met name het verlies of artefact verplaatsing van EGFP-gelabelde membraanreceptoren. Dus, zoals afzonderlijke cellen worden gevolgd in de tijd, de subcellulaire lokalisatie van receptoren kunnen worden afgebeeld en gemeten. Afbeeldingen moeten worden verworven sufficiently snel tot een snelle blaasje beweging vast te leggen. Maar bij hogere belichtingssnelheden, het aantal fotonen verzameld verminderd. Compromissen moeten worden gemaakt in de keuze van beeldvormende parameters zoals voxel om beeldvorming snelheid te winnen. Significante toepassingen van levende cellen beeldvorming om eiwittransport, migratie, proliferatie, celcyclus, apoptose, autofagie en eiwit-eiwit interactie en dynamiek bestuderen om maar enkele te noemen.
Introduction
Het algemene doel is om kwantitatieve gegevens in tijd en ruimte van de receptor colocalization met specifieke subcellulaire organellen krijgen na behandeling met een receptor agonist. Aldus onmiddellijke doel is hier om time-lapse confocale beelden van lysosomen en een transmembraan spanning receptor in humane embryonale niercellen (HEK) na transfectie en vervolgens verzamelen en analyseren van de beeldgegevens in 3D kwantitatief meten van de afgifte van receptor vastleggen lysosomen. Onderzoeken van de gelijktijdige handel in een transmembraan receptor met lysosomen of andere organellen tijdens endocytose wanneer geactiveerd door receptor ligand kan helpen bepalen hoe de transmembraan receptor wordt gereguleerd onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.
AT 1a R wordt geacht te zijn afgebroken in lysosomen na behandeling met Ang II model celsystemen, vooral HEK293 1 hoewel de meerderheid van receptors zijn voornamelijk gelokaliseerd in multivesiculaire recycling endosomen voor latere overdracht naar de plasmamembraan terwijl het grootste deel van de ligand, Ang II, afgebroken in het lysosoom 2, 3, 4, 5. Meer recent, Li et al. aangetoond met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) en fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) technieken die op 1a R colocalizes (op ~ 10 nm schaal) LAMP1, een lysosomale membraaneiwit suggereren dat ten minste enkele van de receptor is gericht op en afgebroken door lysosomen 6. Deze auteurs opgemerkt dat de lysosomale remmer chloroquine geblokkeerde AT 1a R-LAMP1 vereniging die is in overeenstemming met eerdere rapporten suggereren dat een effect van chloroquine is om fusie van de late endosomen of autofagosomen met lysosomen te blokkeren. Andere indirecte methoden om te bepalen op 1a R localization in lysosomen hebben gebruikt bafilomycine, een lysosomale remmers afgeleid op 1a R aanwezig in lysosomen 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Live-cell imaging vermijdt mogelijke gevolgen van fixatie op celvolume en verlies / dimmen / herverdeling van GFP-chimere receptor. Eerdere studies hebben ingeroepen gefixeerde cellen aan colocalization of samen voorkomen van de receptor met lysosomen of met levende cellen gemerkt met receptorbinding surrogaten bepalen zoals β-arrestine 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-cell imaging van andere GPCR's met behulp van draaiende schijf confocale laser of point scanning confokale microscopen uitgerust met de Gaasp of hyd detectoren ingeschakeld onderzoekers aan de internalisering van en handel in receptoren in individuele cellen afgebeeld in z-stacks op 30 s intervallen 9, 10 observeren. Maar zelfs als levende cellen z-stacks snel worden verzameld, kan de analyse pas na selectie van een enkel vlak binnen elke stapel, dwz in 2D 10. Hoewel dit voldoende kan zijn voor het bestuderen van geïnternaliseerde GPCR of tyrosine kinase receptor in kwestie, de AT 1a Rs ophoopt in blaasjes die grootte en de positie in de tijd en zijn derhalve inherent moeilijk voldoende monster met een representatief snee op elk tijdstip. Om de route van het gemerkte AT 1a R door de cel en elke subpopulatie van vesicles die verschillen in grootte en positie detecteren grondig te bepalen, hebben wij een methode ontwikkeld voor 3D beeldvorming en 3D analyse om deze veranderingen te volgen en te in combinatie met kenmerken van verschillende intracellulaire compartimenten zoals lysosomen.
Onderzoekers kunnen dit protocol live-cell imaging om de beweging van AT 1a R direct zichtbaar in de cel en het naar subcellulaire compartimenten na Ang II stimulatie. Subcellulaire compartimenten zijn gelabeld met fluorescerend eiwit chimaera's of andere fluorescente merkers. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een eerste benadering van receptoren in subcellulaire organellen met een minimale resolutie van 200 nm lokaliseren ter vergelijk gemuteerd versus wild-type receptoren of aan veranderingen na farmacologische behandelingen detecteren. De techniek is bereikbaar omdat het op elke confocale microscoop uitgerust voor levende cellen beeldvorming kan worden uitgevoerd. Het relatieve gemak van deze benadering contrasteert met verhoogde deskundigheid en apparatuur die nodig FRET / FLIM / BRET technieken welke moleculaire interacties detecteren 6 uit te voeren,"xref"> 11. Deze metingen definiëren eiwit-eiwit interacties met hoge resolutie (~ 10 nm) en lokalisatie binnen subcellulaire organellen is afgeleid. Deze meer geavanceerde technieken worden gebruikt om te volgen en verder te definiëren moleculaire interacties plaats, in plaats van de doorgang van receptoren, subcellulaire compartimenten en zij rechtstreeks eiwit-eiwit interacties op bepaalde tijdstippen en plaatsen aantonen binnen de cel 11. FLIM, een FRET techniek onafhankelijk van de acceptor concentratie, wordt meestal uitgevoerd op vaste monsters sinds beeldacquisitie is langzamer. Daarentegen verhouding FRET biedt snelle beeldvorming en hoge resolutie colokalisatie van interagerende eiwitten. Het nadeel van verhouding FRET is dat beeldvorming gebruikt groothoek epi-fluorescentie imaging snelheid te winnen en de gehele cel, wat resulteert in gereduceerde resolutie en contrast van organellen 12 omvatten. Bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) is een andergeavanceerde techniek die is toegepast op GPCR's aan de overname van de moleculaire nabijheid te meten in de tijd 11. In deze techniek een eiwit fluorofoor moleculair verdeeld en elke helft gekoppeld aan één van twee eiwitten betrokken. Wanneer de twee eiwitten van belang binden elkaar, het delen van het chimere tag opnieuw assembleren fluorescentie en de verhoogde fluorescentie gekwantificeerd tijd krijgen.
Hier presenteren we een eenvoudige techniek voor live cell imaging in combinatie met image kwantificering tot smokkel van AT 1a R studeren in de cel na Ang II stimulatie en de mogelijke verandering in de levering van geïnternaliseerde AT 1a R om lysosomen na Ang II stimulatie. Het uiteindelijke gebruik van deze techniek is om verschillen in membraantransport vergelijken wildtype en gemuteerde receptoren te karakteriseren. Deze verschillen zullen helpen om het mechanisme (s) die van invloed zijn fysiologische activiteiten van AT 1a R leadi identificerenng tot regulering van de bloeddruk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voorlopige experimenten hier gepresenteerde illustreren dat over een vrij korte tijdsverloop van 24 min, geen merkbare verandering in de levering van AT 1a R-GFP aan de lysosomen plaatsgevonden. In het algemeen kan afgifte van geïnternaliseerd receptoren lysosomen al 15-20 min optreden. Dit experiment is consistent met de hypothese dat het merendeel van de geïnternaliseerde AT 1a R is gericht op grote perinucleaire endosomen. Bewijs dat althans een aantal op 1a R komt in lysosomen werd…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek dat in dit manuscript werd ondersteund door subsidie R01 HL121456-01A1 aan Kathryn Sandberg. Dit werk werd ondersteund in aanvulling op de beschikbaarheid van een Leica SP8 AOB in de Microscopie en Imaging Shared Resource (MISR) aan Georgetown University Medical Center, die deels wordt gefinancierd door P30-CA051008 van de National Institutes of Health van de Verenigde Staten van Amerika. Wij dankbaar erkennen Leica SP8 imaging bijstand van Peter Johnson, en het gebruik van de Zeiss LSM880 in het laboratorium van Thomas Coate, Departement Biologie aan de Georgetown University met imaging bijstand van Alma Arnold van Carl Zeiss Microscopy LLC. De inhoud van dit manuscript is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Referenzen
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
