Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti
Summary
Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.
Abstract
Canlı hücre görüntüleme aynı anda anjiotensin II (Ang II) ile uyarılmasını takiben transfekte insan embriyonik böbrek-293 (HEK) hücreleri anjiotensin tip 1a (1a R AT) reseptörleri ve hücre içi bölmelerin zaman atlamalı görüntü yakalamak için kullanılır. HEK hücreleri geçici plazmid DNA gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş 1a R AT içeren transfekte edilir. Lizozomlar kırmızı floresan boya ile tanımlanır. Canlı hücre görüntüleri Ang II uyarıldıktan sonra bir lazer tarama konfokal mikroskop yakalanan ve zamanla üç boyutlu (3D, vokseller) yazılım tarafından analiz edilir. Canlı hücre görüntüleme reseptör kaçakçılığı soruşturma sağlar ve tespit ile ilişkili boşa önler ve özellikle, EGFP etiketli membran reseptörlerinin kaybı veya artefactual deplasman. tek tek hücreler bir süre ile izlenir Böylece, reseptörlerin hücre içi lokalizasyonu görüntülenmiş ve ölçülebilir. Görüntüler sufficientl edinilmesi gerekiry hızla hızlı vezikül hareketini yakalamak için. Bununla birlikte, hızlı bir görüntüleme hızlarda toplandı, fotonların sayısı azalır. Uzlaşmalar da görüntüleme hız kazanmak amacıyla voksel boyutu gibi görüntüleme parametrelerinin seçimi yapılmalıdır. canlı hücre görüntüleme önemli uygulamaları ama bir kaç isim protein kaçakçılığı, göç, çoğalmasını, hücre döngüsü, apoptoz, otofaji ve protein-protein etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için vardır.
Introduction
genel amacı, reseptör agonisti ile muamele edildikten sonra zaman ve belirli bir alt-hücresel organel reseptör ko alan sayısal kanıtı elde etmektir. Bu nedenle, burada acil hedefi zaman atlamalı konfokal lizozomlar görüntülerini ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde reseptör (HEK) elde edildi reseptörün yayınlamak için 3 boyutlu görüntüleme verileri transfeksiyonu takiben ve daha sonra bir araya getirmek ve analiz kapsayan bir transmembran yakalamak için lizozomlar. transmembran reseptör fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda nasıl düzenlendiği belirlemenize yardımcı olabilir reseptör ligandı tarafından aktive edildiğinde endositoz sırasında lizozomlar veya diğer organellerin yaptığı bir transmembran reseptör eşzamanlı kaçakçılığının soruşturulmasına.
1a R esas olarak HEK293 1 REC çoğunluğu, ancak örnek hücre sistemleri Ang II ile tedavi sonrası lizozomlar bozunabilen varsayılırligand Ang II kütle lizozom 2, 3, 4, 5 bozulmuş ise eptors özellikle plazma membran daha sonra geri dönüşüm için multiveziküler geri kazanım endozomlarda lokalizedir. Daha yakın zamanda, Li ve diğ. Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve floresan süresi görüntüleme mikroskobu (FLIM) teknikleri kullanılarak ortaya AT 1a R colocalizes LAMP1 ile (~ 10 nM ölçekte) reseptörünün en azından bir kısmı için hedeflenen ve düşer düşündüren bir lizozomal membran proteini lizozomlarında 6 ile. Bu yazarlar lizozomal inhibitörü klorokin klorokin bir etkisi lizozomlarında ile geç endosomes veya autophagosomes füzyon engellemek için olduğunu düşündüren önceki raporlar ile uyumludur 1a R-LAMP1 dernek AT bloke ettiğini kaydetti. Diğer dolaylı yaklaşımlar 1a R l AT belirlemek içinlizozomlarda ocalization, lizozomlarda 3, 4, 5, 6, 7, 8 1a R varlığına anlaması için bir lızozomal inhibitörü bafilomisin kullanmışlardır.
Canlı hücre görüntüleme hücre hacmi ve GFP kimerik reseptörün kaybı / karartma / yeniden dağılımı üzerindeki tespitin potansiyel etkilerini önler. Önceki çalışmalar, ko veya lizozomlar veya reseptör bağlayıcı suretlerle ile etiketlenmiş, canlı hücreleri kullanılarak reseptörün eş oluşumunu belirlemek için, sabit hücre bel bağlar β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. dönen disk konfokal veya lazer noktası tarama conf kullanan diğer GPCRs Canlı hücre görüntülemeGaasp veya HYD dedektörleri ile donatılmış Öçal mikroskoplar 30 s aralıklarla 9, 10, z-yığınlarının görüntülü bireysel hücrelerin reseptör içselleştirilmesi ve ticaretini gözlemlemek için araştırmacılar sağladı. Canlı hücre z-yığınları hızla toplanır Ancak bile, analiz sadece 2D 10 yani her yığının içinde tek bir düzlemde seçimden sonra ortaya çıkabilir. Bu soru içselleştirilmiş GPCR veya tirozin kinaz reseptörü çalışmak için yeterli olabilir, AT 1a Rs zamanla boyutunu ve konumunu değiştirmek ve böylece doğal yeterli her zaman bir noktada temsili tek dilim kullanarak örnek daha zor kesecikler birikir. Iyice hücre yoluyla ve boyut ve konumda farklı veziküller her ICSI'nin tespit etmek 1a R AT etiketli rota belirlemek için, 3D görüntüleme ve 3D analizi için bir yöntem bu değişiklikleri izlemek ve olmaya taktığı Bu lizozomlar gibi çeşitli hücre içi bölmelerin etiketleme ile birlikte kullanılır.
Müfettişler doğrudan hücre ve Ang II uyarımı aşağıdaki hücre içi bölmelere onun transferi içine AT 1a R hareketini görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme için bu protokolü kullanabilirsiniz. Hücre içi bölmeleri floresan protein kuruntulardan ya da diğer floresan işaretleri ile etiketlenir. Bu protokol, aynı zamanda, vahşi tip reseptörlere karşı mutasyona karşılaştırma ya da farmakolojik tedavi aşağıdaki değişiklikleri tespit etmek için, 200 nm'lik bir çözünürlüğü en az sub-hücresel organellerde reseptörleri lokalize bir ilk yaklaşım olarak kullanılabilir. Bu canlı hücre görüntüleme için donatılmış bir konfokal mikroskop gerçekleştirilebilir çünkü tekniğin erişilebilir. Bu yaklaşımın göreli kolaylığı, artan uzmanlık ve moleküler etkileşimleri 6 tespit FRET / flim / BRET teknikleri yürütmek için gerekli ekipman ile çelişmektedir"xref"> 11. Bu ölçümler, yüksek çözünürlüklü (~ 10 nm) ve sub-hücresel organeller içerisinde lokalizasyonu anlaşılmaktadır protein-protein etkileşimlerini tanımlamaktadır. Bunlar daha ileri teknikler takip ve ileri moleküler ilgi etkileşimleri yerine hücre içi bölmeleri sayesinde reseptörlerin geçişini tanımlamak için kullanılır ve doğrudan hücreye 11 içinde belirli zamanlarda ve yerlerde protein-protein etkileşimleri göstermektedir. görüntü elde etme yavaş olduğu FLIM, alıcı konsantrasyonu bağımsız bir FRET tekniği, genellikle sabit bir numune üzerinde gerçekleştirilir. Buna karşılık, bu oran FRET hızlı görüntüleme ve etkileşim proteinlerin yüksek çözünürlüklü ko sağlar. Oran FRET dezavantajı görüntüleme widefield epi-floresan görüntüleme hız kazanmak ve düşük çözünürlükte ve organellerin 12 aksine sonuçlanan tüm hücre içerecek şekilde kullanmaktadır olduğunu. Biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret) başka bir şeydirzaman 11 üzerinde moleküler yakınlığı edinilmesini ölçmek için GPCRs uygulanmıştır ileri tekniği. Bu teknikte, bir protein florofor moleküler bölünür ve her yarım, söz konusu iki proteinin birine bağlandı. Ne zaman faiz bağlama iki protein birbirlerine, kimerik etiketinin parçaları floresan ve zamanla sayısal artan floresan elde etmek monte yeniden.
Burada, Ang II uyarımı ve Ang II uyarımı aşağıdaki lizozomlar için 1a R AT içselleştirilmiş teslim potansiyel değişim üzerine hücrede AT 1a R ticaretini incelemek için görüntü ölçümü ile birleştiğinde canlı hücre görüntüleme için basit bir teknik sunuyoruz. Bu teknik için nihai kullanımı yabani tip ve mutasyona uğramış reseptörleri karşılaştıran membran kaçakçılığı farklılıkları karakterize etmektir. Bu farklılıklar AT 1a R leadi fizyolojik faaliyetlerini mekanizmasını (ler) etkisini belirlemeye yardımcı olacaktırkan basıncının düzenlenmesi ng.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan ön deneyler 24 dakika gibi kısa bir sürede boyunca, lizozomlar AT 1a R-GFP teslim kayda değer bir değişiklik meydana geldiğini göstermektedir. Genel olarak, lızozomlara içselleştirilmiş reseptörlerin teslim gibi erken 15-20 dakika olarak meydana gelebilir. Bu deney 1a R AT içselleştirilmiş toplu büyük perinükleer endozomlardan hedeflenmektedir hipotezi ile tutarlıdır. R lizozomlarında geldiğinde 1a AT en azından bazı Li ve arkadaşları ta…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazıda sunulan araştırma çalışmaları Kathryn Sandberg hibe R01 HL121456-01A1 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri P30-CA051008 tarafından finanse edilmektedir Georgetown Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Mikroskopi ve Görüntüleme Paylaşılan Kaynak (MISR) bir Leica SP8 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor kullanılabilirliği ile ek desteklenmiştir. Biz minnetle Leica SP8 görüntüleme Peter Johnson tarafından asistanlığı ve Carl Zeiss Mikroskopi LLC Alma Arnold tarafından sağlanan görüntüleme yardımı ile Georgetown Üniversitesi'nde Thomas Coate, Biyoloji Bölümü laboratuarında Zeiss LSM880 kullanımını kabul. Bu yazıda içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Referenzen
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
