Живая съемка Cell и 3D Анализ ангиотензина типа 1a Торговля в трансфицированных человеческих эмбриональных клеток почки с помощью конфокальной микроскопии
Summary
Здесь мы приводим протокол к клеткам изображения, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок-меченый типа ангиотензина 1a рецепторы во время эндоцитоза, инициированные лечения ангиотензина II. Этот метод включает в себя маркировочные лизосом со вторым флуоресцентным маркером, а затем программное обеспечение, использующие для анализа совместной локализации рецептора и лизосом в трех измерениях с течением времени.
Abstract
Живых клеток используется для одновременного захвата покадровой изображения 1a рецепторов типа ангиотензина (AT 1a R) и внутриклеточным в трансфицированных человеческих эмбриональных почек-293 (НЕК) клеток после стимуляции ангиотензина II (Ang II). Клетки НЕК которые трансфицированы плазмидной ДНК , содержащей AT 1a R меченой с улучшенным зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Лизосомы идентифицированы с красным флуоресцентным красителем. Live-ячейки изображения, снятые на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии после стимуляции Ang II и анализировали с помощью программного обеспечения в трех измерениях (3D, вокселей) с течением времени. живых клеток позволяет расследование незаконного оборота рецептора и избегает путает, связанных с фиксацией, и в частности, утрата или артефактного перемещение EGFP-меченых мембранных рецепторов. Таким образом, как отдельные клетки отслеживаются через время, субклеточных локализации рецепторов можно визуализировать и измерить. Изображения должны быть приобретены sufficientlу быстро захватить быстрое перемещение везикул. Тем не менее, при более высоких скоростях обработки изображений, число фотонов, собранных уменьшается. Компромиссы также должны быть выполнены при выборе параметров обработки изображений, таких как размер воксела, чтобы получить скорость обработки изображений. Значительные применения живых клеток являются изучение незаконного оборота белка, миграцию, пролиферацию, клеточный цикл, апоптоз, взаимодействие аутофагии и белок-белок и динамику, чтобы назвать только некоторые из них.
Introduction
Общая цель состоит в том, чтобы получить количественные данные во времени и пространстве рецепторов колокализации с конкретными субклеточных органелл после обработки агонистом рецептора. Таким образом, ближайшая цель здесь заключается в захвате покадровой конфокальной образы лизосом и трансмембранного рецептора в эмбриональных клетках почки человека (HEK) после трансфекции и затем собрать и проанализировать данные изображений в 3D, чтобы количественно измерить доставку рецептора лизосом. Исследуя одновременно торговлей трансмембранного рецептора с лизосом или других органелл во время эндоцитоза при активации лиганда рецептора может помочь определить, как трансмембранный рецептор регулируется при физиологических и патофизиологических условиях.
AT 1a R предполагается разлагаться в лизосомах после обработки Ang II в модельных системах клеток, в первую очередь HEK293 1 , хотя большинство гееeptors в основном локализованы в мультивезикулярных эндосомами рециркуляции для последующего повторного использования в плазматическую мембрану в то время как основная масса лиганда, Ang II, деградирует в лизосомы 2, 3, 4, 5. Совсем недавно, Ли и др. продемонстрирована с использованием передачи Фёрстера энергии резонанса (FRET) и флуоресцентной микроскопии срок службы томографии (FLIM) методы , которые АТ 1a R колокализуется (на ~ 10 нм масштабе) с ЛАМПА1, лизосомального мембранный белок , предполагая , что по крайней мере некоторые из рецептора нацелен на и деградирует лизосомами 6. Эти авторы отметили , что ингибитор лизосомальная хлорохин заблокирован AT 1a R-LAMP1 ассоциации , которая согласуется с предыдущими сообщениями о том , что эффект хлорохина является блокирование слияния поздних эндосом или автофагосомы с лизосом. Другие косвенные подходы к определению AT 1a R Localization в лизосомах использовали bafilomycin, ингибитор лизосомальное вывести при наличии 1a R в лизосомах 3, 4, 5, 6, 7, 8.
живых клеток позволяет избежать потенциальных эффектов фиксации по объему клеток и потере / затемнением / перераспределения GFP-химерного рецептора. Предыдущие исследования полагались на фиксированные клетки , чтобы определить , колокализацию или смежности рецептора с лизосомы или с использованием живых клеток , меченных суррогатами связывающих рецептор , таких как β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-ячейки изображения других GPCRs с помощью конфокальной вращающийся диск или лазерной сканирующей точки конфÖçal микроскопы , оснащенные датчиками GaAsP или Hyd позволило исследователям наблюдать за интернализации и оборота рецепторов в отдельных клетках отображенных в Z-стеки по 30 с интервалом 9, 10. Тем не менее , даже если живая клетка Z-стеки быстро собираются, анализ может происходить только после выбора одной плоскости в пределах каждого стека, т.е. в 2D 10. В то время как это могло бы быть достаточно для изучения интернализированный GPCR или тирозин киназный рецептор в вопросе, 1а ЗС в п накапливается в пузырьках , которые изменяют размер и положение с течением времени и , таким образом , по своей природе более трудно адекватно образец с использованием репрезентативного единственного среза в каждый момент времени. Для того, чтобы тщательно определить маршрут меченый AT 1a R через ячейку и обнаруживать каждый субпопуляции везикулы , различающихся по размеру и положению, мы разработали метод для 3D визуализации и 3D – анализа , чтобы отслеживать эти изменения и быть используется в сочетании с маркировки различных внутриклеточных компартментах, таких, как лизосомы.
Исследователи могут использовать этот протокол для живых клеток изображений непосредственно визуализировать движение AT 1a R в клетку и ее передачи в субклеточных отсеков после стимуляции Ang II. Субклеточные отсеки помечены флуоресцентным белком химер или других флуоресцентных маркеров. Этот протокол также может быть использован в качестве первого подхода к локализации рецепторов в субклеточных органелл с минимальным разрешением 200 нм для того, чтобы сравнить мутировали против рецепторов дикого типа или для обнаружения изменений после фармакологического лечения. Техника доступна, так как оно может быть осуществлено на любом конфокальный микроскоп, оснащенный для живых клеток. Относительная простота этого подхода контрастирует с увеличением опыта и оборудования , необходимого для проведения FRET / FLIM / методы Брет, распознающие молекулярные взаимодействия 6,"Xref"> 11. Эти измерения определяют белок-белковых взаимодействий с высоким разрешением (~ 10 нм) и локализация в пределах внутриклеточных органелл выводится. Эти более продвинутые методы используются для наблюдения и дальнейшего определения молекулярных взаимодействий , представляющих интерес, а не прохождение через рецепторы субклеточных отсеков, и они непосредственно демонстрируют белок-белковых взаимодействий в определенное время и в местах внутри клетки 11. FLIM, метод FRET зависит от концентрации акцепторной, чаще всего выполняется на фиксированных образцов, так как получение изображений происходит медленнее. В противоположность этому, соотношение FRET обеспечивает быстрое и обработки изображений с высоким разрешением колокализацию взаимодействующих белков. Недостатком соотношения FRET является то , что визуализация использует с широким полем зрения эпи-флуоресценцию , чтобы получить скорость обработки изображений и включить всю клетку, что приводит к уменьшению разрешения и контрастности органелл 12. передача Биолюминесценция энергия резонанса (BRET) является еще однимпередовая техника , которая была применена к GPCRs для измерения приобретения молекулярной близости с течением времени 11. В этой технике белок флуорофор молекул рно разделены и каждая половина связана с одним из двух белков, о которых идет речь. Когда два нужных белков, связываются друг с другом, части химерного тега Сборку приобрести флуоресценции и повышенную флуоресценцию количественно с течением времени.
Здесь мы представляем простой метод для живых клеток изображений в сочетании с количественной оценки изображения для изучения торговли AT 1a R в клетке после стимуляции Ang II и потенциального изменения в доставке усвоены AT 1a R в лизосомы после стимуляции Ang II. Конечной использование этого метода заключается, чтобы охарактеризовать различия в мембранном сравнивающие дикого типа и мутантных рецепторов. Эти различия помогут определить механизм (ы) , которые влияют физиологические активности AT 1a R leadiнг регуляции кровяного давления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предварительные эксперименты , представленные здесь , показывают , что в течение довольно короткого времени течение 24 мин, без заметного изменения в поставке AT 1a R-GFP в лизосомах не произошло. В общем, поставка интернализированных рецепторов к лизосом может произойти уже в 15-20 мин. ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Научно-исследовательская работа представлена в этой рукописи была поддержана грантом R01 HL121456-01A1 к Kathryn Сандберг. Эта работа была поддержана в дополнение наличием в Leica SP8 АОБ в микроскопии и обработки изображений совместно используемых ресурсов (MISR) в Джорджтаунском университете Медицинского центра, который частично финансируется P30-CA051008 из Национальных институтов здравоохранения Соединенных Штатов Америки. Мы выражаем глубокую признательность Leica помощь SP8 изображения Питера Джонсона, а также использование Цейсс LSM880 в лаборатории Томаса Coate, факультет биологии в Джорджтаунском университете, с помощью визуализации, предоставленной Alma Арнольд Carl Zeiss Микроскопия LLC. Содержание в этой рукописи является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Referenzen
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
