تحليل إنهاء النسخ عن طريق النسخ على تشغيل (TRO) نهج BrUTP حبلا محددة
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
توضح هذه المخطوطة بروتوكول للكشف عن النسخ إنهاء الخلل في الجسم الحي. بروتوكول TRO-حبلا محددة صفها باستخدام BrUTP هنا هو المنهج التجريبي قوية لتحليل عيب إنهاء النسخ في ظل الظروف الفسيولوجية. مثل فحص TRO التقليدي، فإنه يعتمد على وجود البلمرة نشط transcriptionally وراء نهاية 3 'من الجينات كمؤشر من النسخ إنهاء عيب 1. فإنه يتغلب على مشكلتين رئيسيتين واجهتها مع مقايسة TRO التقليدي. أولا، فإنه يمكن الكشف إذا كان البلمرة القراءة من خلال إشارة الإنهاء هو الذي بادر النسخ من منطقة المروج القريبة، أو إذا كان ببساطة يمثل البلمرة الكتابة انتشارا التي بدأت غير تحديدا من مكان ما في الجسم أو "3 نهاية هذا الجين. ثانيا، يمكن أن نميز إذا كانت إشارة البلمرة النشطة transcriptionally خارجالمنطقة فاصل هي حقا readthrough البلمرة الشعور مرنا الكتابة أو مكافحة الشعور إشارة غير الترميز الحمض النووي الريبي بدأ فاصل. لفترة وجيزة، ويشمل البروتوكول permeabilizing خلايا الخميرة تنمو باطراد، مما يتيح للنصوص التي بدأت في الجسم الحي لإطالة بحضور النوكليوتيدات BrUTP، وتنقية RNA المسمى BrUTP من قبل نهج تقارب، عكس الكتابة الحمض النووي الريبي الوليدة النقي وتضخيم [كدنا باستخدام الاشعال حبلا محددة المرافقة المروج والمناطق فاصل من الجين 2.
Introduction
تتكون دورة النسخ حقيقية النواة من ثلاث خطوات رئيسية. بدء، واستطالة وإنهاء الخدمة. إنهاء النسخ التي كتبها RNA البلمرة الثاني يتكون من اثنين متميزة، خطوات مترابطة 3. تتضمن الخطوة الأولى الانقسام، تذييل بعديد الأدينيلات وإطلاق مرنا من القالب، ويليه مباشرة الخطوة الثانية، التي تميزت فك الارتباط من البلمرة من القالب. إنهاء السليم هو أمر حاسم لإعادة التدوير من خلال البلمرة بدء / باستعادة النسخ، لمنع التدخل في النسخ من الجينات المصب، وحفظ النسخ الشاذة في الاختيار عن طريق الحد من النسخ من انتشارا غير الترميز الحمض النووي الريبي 4 و 5. وعلى الرغم من التطورات الحديثة، وإنهاء هو إلى حد بعيد أقل خطوة يفهم من دورة النسخ RNA البلمرة الثاني. إنهاء الخدمة فحص موثوق ضروري لدراسة آلية underlyinز إنهاء النسخ التي كتبها RNA البلمرة الثاني في الجسم الحي.
ويستخدم عدد من المناهج التجريبية للكشف عن الخلل إنهاء في الجينات الاختزال بنشاط في ظل الظروف الفسيولوجية. وتشمل هذه وصمة عار الشمالية، عامل إنهاء رقاقة (لونين مناعي) وفحص TRO التقليدي. كل من هذه التقنيات لديها بعض المزايا والعيوب. فحص TRO التقليدية المستخدمة ليكون النهج الأكثر موثوقية وحساسة للكشف عن وجود خلل إنهاء النسخ في الجسم الحي 1. هذا الاختبار يموضع الجزيئات النشطة البلمرة transcriptionally على مناطق مختلفة من الجينات داخل الخلية. في ظل ظروف طبيعية، ويظهر فحص الجزيئات البلمرة المتفاعلة transcriptionally موزعة بدقة بين المروج وفاصل المنطقة من الجين (الشكل 1A). عند انتهاء معيب، ومع ذلك، فإن البلمرة غير قادر على قراءة إشارة الإنهاءويتم الكشف في منطقة المصب من 'نهاية 3 من الجين (الشكل 1B).
ويتجلى عيب إنهاء النسخ في وجود البلمرة إحساس-الاختزال التي بدأت من منطقة المروج القريبة، وعدم القدرة على قراءة إشارة الإنهاء، تواصل الكتابة في منطقة المصب من نهاية 3 'من الجينات كما هو مبين في الشكل 2A. مع إدراك أن جينوم وحيد الخلية المعارض النسخ انتشارا هائلا في المعنى وكذلك الاتجاهات المضادة للمعنى في وحول الجينات 6، 7، 8، 9، 10، وسرعان ما أصبح واضحا أن TRO الفحص التقليدي لا يمكن الكشف عن إذا كانت إشارة البلمرة المصب من الجين يمثل نسخة بمبادرة المروج (الشكل 2A) أو الحمض النووي الريبي الشاذة التي بدأت سومewhere في منتصف هذا الجين أو المصب من عنصر فاصل (الشكل 2B)، أو الاختزال البلمرة في اتجاه مضاد للإحساس من نهاية 3 'من الجين (الشكل 2C). فحص TRO-حبلا محددة صفها باستخدام BrUTP هنا يمكن التمييز إذا تمثل إشارة البلمرة readthrough ملاحظ بدأت المروج الشعور الموسعة مرنا أو مستخرج مكافحة بمعنى أن بدأت المصب من الجينات قيد البحث والدراسة. وقد استخدمنا بنجاح هذا النهج للتدليل على دور كيناز Kin28 في إنهاء النسخ في مهدها الخميرة 2. إستخدام أسلوب هنا تبين لنا أن Rna14 هو مطلوب لإنهاء النسخ من ASC1 في مهدها الخميرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تعديل بروتوكول TRO-حبلا المحددة المستخدمة هنا من البروتوكول المستخدم لاللائحة العامة للمنظمة تسلسل (العالمية تدار على التسلسل) تحليل في خلايا الثدييات 12. نحن تعديل بنجاح بروتوكول لدراسة النسخ الوليدة في مهدها الخميرة. لتحليل تحديدا الخلل إنهاء النسخ،…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referenzen
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al. The reality of pervasive transcription. PLoS Biol. 9 (7), e1000625 (2011).
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
