Analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van BrUTP-streng-specifieke transcriptie Run-on (TRO) Approach
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het detecteren transcriptieterminatie defect in vivo. De streng-specifieke TRO protocol gebruikt BrUTP beschreven is een krachtige experimentele benadering voor het analyseren van de transcriptie beëindiging defect onder fysiologische omstandigheden. Als de traditionele TRO assay is gebaseerd op de aanwezigheid van een transcriptioneel actieve polymerase voorbij het 3 'uiteinde van het gen als een indicator van een transcriptie terminatie defect 1. Het overwint twee grote problemen met de traditionele TRO test. Ten eerste kan het detecteren of het polymerase lezen door het terminatiesignaal is die transcriptie geïnitieerd van de promoter-proximale regio, of simpelweg vertegenwoordigt een pervasively transcriberen polymerase die aspecifiek geïnitieerd ergens in het lichaam of het 3' uiteinde van het gen. Ten tweede kan onderscheiden of het transcriptioneel actieve polymerase-signaal buiten hetterminatorgebied werkelijk de readthrough sense mRNA transcriberen polymerase of een terminator geïnitieerde niet-coderende antisense RNA signaal. Kort samengevat, het protocol omvat permeabilisatie de exponentieel groeiende gistcellen, waardoor de transcripten die in vivo gestart te rekken in aanwezigheid van de BrUTP nucleotide zuiveren BrUTP gelabelde RNA met de affiniteit benadering reverse transcriberen het gezuiverde ontluikende RNA en amplificatie van het cDNA met behulp strengs specifieke primers aan weerszijden van de promoter en terminator gebieden van het gen 2.
Introduction
De eukaryotische transcriptie cyclus bestaat uit drie belangrijke stappen; initiatie, verlenging en beëindiging. De beëindiging van de transcriptie door RNA-polymerase II bestaat uit twee afzonderlijke, onderling afhankelijke stappen 3. De eerste stap is splitsing en afgifte polyadenylatie van mRNA uit de matrijs en wordt onmiddellijk gevolgd door de tweede stap, gekenmerkt door losmaken van polymerase van de sjabloon. Juiste afsluiting is cruciaal voor de recycling van de polymerase bij aanvang / her-initiatie van transcriptie, het voorkomen interferentie met de transcriptie van downstream genen, en het bijhouden van afwijkende transcriptie controle door het beperken transcriptie van doordringende niet-coderende RNA 4, 5. Ondanks recente vooruitgang beëindiging veruit de minst begrepen stap van het RNA polymerase II de transcriptie cyclus. Een betrouwbare beëindiging test is essentieel voor het bestuderen van het mechanisme underlying beëindiging van transcriptie door RNA polymerase II in vivo.
Een aantal experimentele benaderingen worden gebruikt om de beëindiging defect in een actief transcriberen gen onder fysiologische ziektebeelden. Deze omvatten Northern blot, beëindiging factor chip (Chromatine Immunoprecipitatie) en de traditionele TRO test. Elk van deze technieken heeft voordelen als nadelen. De traditionele TRO assay gebruikt om de meest betrouwbare en gevoelige benadering voor de detectie van een transcriptie terminatie defect in vivo 1 zijn. Deze test lokaliseert het transcriptioneel actieve polymerase moleculen op verschillende gebieden van een gen in de cel. Onder normale omstandigheden het assay toont gekoppelde transcriptie polymerase moleculen strikt verdeeld tussen de promoter en terminator van het gen (Figuur 1A). Na beëindiging defecte echter het polymerase in staat is de beëindiging uitgelezen signaalen wordt gedetecteerd in het gebied stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van het gen (Figuur 1B).
Een transcriptieterminatiesequentie defect manifesteert in aanwezigheid van een sense-transcriptie polymerase dat geïnitieerd van de promoter-proximale gebied, en niet in staat om de beëindiging uitgelezen signaal blijft transcriptie van het gebied stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van een gen zoals getoond in figuur 2A. Met het besef dat de eukaryote genoom vertoont overweldigend alomtegenwoordig transcriptie in zin evenals anti-sense richtingen in en rond een gen 6, 7, 8, 9, 10, werd al snel duidelijk dat de traditionele TRO test niet kan detecteren of de polymerase signaal stroomafwaarts van een gen betekent een promotor geïnitieerd transcript (Figuur 2A) of een afwijkende RNA dat som ingeleidewhere in het midden van het gen of stroomafwaarts van de terminator element (figuur 2B) of de polymerase transcriptie van de antisense richting vanaf het 3 'uiteinde van het gen (Figuur 2C). De streng-specifieke TRO assay gebruikt BrUTP beschreven kunnen onderscheiden of de waargenomen readthrough polymerase-promoter representeert geïnitieerde verlengde sense mRNA of een antisense transcript dat stroomafwaarts van het gen onderzochte ingeleid. We hebben met succes deze benadering gebruikt om de rol van Kin28 kinase beëindiging van transcriptie aangetoond in gist 2. Gebruikmakend van de aanpak hier laten we zien dat Rna14 nodig is voor de beëindiging van de transcriptie van ASC1 in gist.
Protocol
Representative Results
Discussion
De streng-specifieke TRO protocol hier gebruikt werd aangepast van het protocol dat wordt gebruikt voor het GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analyse in zoogdiercellen 12. We hebben met succes het protocol aangepast om ontluikende transcriptie studeren in gist. Om specifiek wat de transcriptie beëindiging defect, aangepast we het protocol verder door zich te ontdoen van de RNA-hydrolyse stap. Dit liet ons toe om specifiek detecteren volledige lengte ontluikende transcripten die geïnitieerd van…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referenzen
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al. The reality of pervasive transcription. PLoS Biol. 9 (7), e1000625 (2011).
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
