BrUTP 가닥 특정 전사 런타임에 (TRO) 접근 방식을 사용하여 전사의 종료의 분석
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
이 원고는 생체 내에서 전사 종결 결함을 검출하는 프로토콜을 설명한다. 사용 BrUTP 여기서 설명한 가닥 특이 TRO 프로토콜은 생리 학적 조건 하에서 전사 종결 결함 분석을위한 강력한 실험 방법이다. 전통적인 TRO 분석 마찬가지로 전사 종결 결함 하나의 지표로서 유전자의 3 '말단을 넘어 전사적 활성 폴리머의 존재에 의존한다. 그것은 기존의 TRO 분석으로 발생하는 두 가지 주요 문제를 극복한다. 첫째, 종료 신호를 통해 판독 효소가 프로모터 근위 부위에서 전사를 개시 한 경우, 검출 또는 수 단순히 어딘가에 본문에서 비특이적 개시된 pervasively 전사 효소 또는 3 '을 나타내는 경우 유전자의 끝. 둘째, 구별 할 수 있습니다 경우 넘어 전사적으로 활성 효소 신호터미네이터 영역은 진정으로 readthrough 감지 mRNA의 전사 중합 효소 또는 터미네이터 시작 비 코딩 안티센스 RNA 신호이다. 간략하게, 프로토콜, 기하 급수적으로 성장하는 효모 세포 permeabilizing 친화 방식으로 BrUTP 표지 RNA 정제의 BrUTP 염기의 존재 하에서 신장 생체 내에서 개시 사체 허용 수반 정제 초기 RNA를 전사하고 cDNA를 증폭하여 역방향 프로모터와 유전자 (2)의 종결 영역을 플 랭킹 가닥 특이 적 프라이머.
Introduction
진핵 전사 사이클은 세 가지 주요 단계로 구성; 개시, 신장 및 종료. RNA 중합 효소 II에 의한 전사의 종료는 두 가지, 상호 의존적 인 3 단계로 구성되어 있습니다. 첫 번째 단계는 템플릿에서 분열, 및 폴리아 데 닐화 mRNA를 분리를 포함하고, 바로 템플릿 폴리머의 결합 해제에 의해 표시된 두번째 단계로 이어진다. 적절한 종료와 RNA (4, 5)를 비 – 코딩 전반의 전사를 제한함으로써 점검 비정상적인 전사를 유지하는 하류 유전자의 전사와 간섭을 방지하기 위해, 전사 개시 / 재개시하는 동안 폴리머의 재활용을 위해 중요하다. 최근의 진보에도 불구하고, 종료는 RNA 중합 효소 II 전사주기까지 상기 단계에 의해 이해된다. 안정적인 종단 분석은 메커니즘 underlyin 연구를위한 필수적이다생체 내에서 RNA 중합 효소 II에 의한 전사의 g 종료.
실험적인 접근 방법은 생리 조건 하에서 활발히 유전자 전사 종결 결함을 검출하기 위해 사용된다. 이 북부 오 점, 종료 인자 칩 (염색질 면역 침전) 및 기존의 TRO 분석을 포함한다. 이들 기술은 각각 장단점을 갖는다. 사용되는 전통적인 TRO 분석은 생체 내 1에서 전사 종결 결함의 검출을위한 가장 신뢰할 수 있고 중요한 방법이 될 수 있습니다. 이 분석은 세포 내부 유전자의 상이한 영역의 전사적 활성 폴리머 분자 편재. 정상적인 조건에서 분석은 엄격히 유전자 (그림 1A)의 프로모터와 터미네이터 영역 사이에 분산 된 전사적으로 참여 중합 효소 분자를 보여줍니다. 결함 종료시 그러나, 폴리머는 종료 신호를 판독 할 수없는상기 유전자 (도 1b)의 3 '말단의 하류 영역에서 검출된다.
전사 종결 결함이 프로모터 근위 영역으로부터 시작된 센스 속기 폴리머의 존재 하에서 적하하고, 종료 신호를 읽을 수 되,도에 도시 된 바와 같이, 유전자의 3 '말단의 하류 영역을 전사 계속 2A. 진핵 게놈 및 유전자 6, 7, 8, 9, 약 10 압도적 보급 점에서 전사뿐만 아니라 안티센스 방향을 나타낸다 실현으로 곧 전통적인 TRO 분석 검출 할 수없는 것은 명백되었다 폴리머 IF 신호 유전자의 하류는 프로모터 시작 성적 증명서 (그림 2A) 또는 솜을 시작 탈선 RNA를 나타냅니다유전자 또는 종단 요소 (도 2b) 또는 유전자 (도 2c)의 3 '말단에서 안티센스 방향의 폴리머 속기 하류의 중간 ewhere. 관찰 readthrough 중합 효소 신호가 프로모터 시작 확장 된 감각의 mRNA 또는 시험에서 유전자의 하류를 시작 안티 센스 성적표를 나타내는 경우 사용 BrUTP는 여기에 설명 된 가닥 특정 TRO 분석은 구별 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 효모 2 신진에서 전사 종료에 Kin28 키나제의 역할을 보여주기 위해이 방법을 사용하고 있습니다. 여기에 방법을 사용하는 우리는 같은 단백질이 효모 신진에서 ASC1의 전사의 종료를 위해 필요하다는 것을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 사용 가닥 특이 TRO 프로토콜은 포유 동물 세포에서 12 GRO-SEQ (글로벌 도망 시퀀싱) 분석을 위해 사용 된 프로토콜에서 적응시켰다. 우리는 성공적으로 효모 신진에서 초기 전사를 연구하는 프로토콜을 수정했습니다. 특히 전사 종결 결함을 분석하기 위해, 우리는 RNA 가수 분해 공정 치우는하여 상기 프로토콜을 조정했다. 이것은 우리가 특히 프로모터 영역 근처의 전사 개…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referenzen
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