Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll Transkriptionsterminierungs Defekt in vivo zu erkennen. Die strangspezifischen TRO-Protokoll BrUTP hier beschrieben ist eine leistungsfähige experimentelle Ansatz für die Transkriptionsterminierungs Defekt unter physiologischen Bedingungen zu analysieren. Wie das traditionelle TRO – Assay beruht auf der Gegenwart einer transkriptionell aktiven Polymerase über das 3' – Ende des Gens als ein Indikator für eine Transkriptions – Terminationssequenz Defekt 1. Es überwindet zwei große Probleme mit dem traditionellen TRO-Test festgestellt. Erstens kann sie erkennen, ob der Polymerase durch das Endsignal liest die ist, die Transkription von dem Promotor-proximalen initiiert Region oder wenn es einfach ist, die eine pervasively Transkribieren Polymerase, die unspezifisch von irgendwo in dem Körper eingeleitet bzw. das 3' Ende des Gens. Zweitens kann es zu unterscheiden, ob die transcriptionsaktive Polymerase-Signal über dieTerminatorregion ist wirklich die Readthrough Sense-mRNA transkribiert Polymerase oder ein Terminator-initiierte nicht-codierende anti-sense RNA-Signal. Kurz gesagt umfasst das Protokoll die exponentiell wachsenden Hefezellen durchdringbar, so dass die Transkripte , die in Gegenwart des BrUTP Nukleotid zu verlängern in vivo initiierten BrUTP-markierte RNA durch die Affinität Ansatz Reinigung in umgekehrter gereinigter naszierende RNA und Amplifizieren der cDNA unter Verwendung Transkribieren strangspezifischen Primern den Promotor und die Terminator – Regionen des 2 – Gens flankieren.
Introduction
Die eukaryotischen Transkription Zyklus besteht aus drei Hauptschritten; Initiation, Elongation und Termination. Die Beendigung der Transkription durch RNA – Polymerase II besteht aus zwei verschiedenen, voneinander abhängigen Schritten 3. Der erste Schritt beinhaltet die Spaltung, die Polyadenylierung und die Freisetzung von mRNA aus der Vorlage, und wird sofort durch den zweiten Schritt, gekennzeichnet durch Ausrücken der Polymerase aus der Vorlage. Ordnungsgemäße Beendigung ist entscheidend für die Wiederverwertung der Polymerase während der Initiierung / Reinitiierung der Transkription, für eine Interferenz mit der Transkription der nachgeschalteten Gene zu verhindern, und für aberrant Transkription unter Kontrolle zu halten , indem die Transkription des Begrenzens pervasive nicht-codierende RNA 4, 5. Trotz der jüngsten Fortschritte ist Kündigung bei weitem am wenigsten verstandenen Schritt der RNA-Polymerase II Transkriptionszyklus. Eine zuverlässige Abschlusstest ist von wesentlicher Bedeutung für die Untersuchung des Mechanismus Sekundärmarkg Termination der Transkription durch RNA – Polymerase II in vivo.
Eine Reihe von experimentellen Ansätze werden verwendet, um die Beendigung Defekt in einem aktiv transkribierten Gen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. Dazu zählen Northern Blot, Terminationsfaktor ChIP (Chromatin Immunopräzipitation) und die traditionelle TRO-Test. Jede dieser Techniken haben einige Vorteile und Nachteile. Die traditionelle TRO – Assay verwendet werden , um verlässliche und sensibles Vorgehen zum Nachweis eines Transkriptionsterminierungs Defekt in vivo 1. Dieser Assay lokalisiert die transkriptionell aktive Polymerase-Moleküle auf den verschiedenen Regionen eines Gens in der Zelle. Unter normalen Bedingungen zeigt der Assay transkriptionell Eingriff Polymerasemoleküle streng zwischen dem Promotor und Terminator – Region des Gens (1A) verteilt. Nach Beendigung defekte, jedoch ist die Polymerase nicht in der Lage das Beendigungssignal zu lesen,und in dem Bereich stromabwärts des 3' – Endes des Gens (1B) detektiert.
Eine Transkriptions – Terminationssequenz Defekt in Gegenwart eines Sinnes Transkribieren Polymerase manifestiert , die aus der Promotor-proximalen Bereich eingeleitet, und nicht in der Lage das Beendigungssignal zu lesen, setzt die Region stromabwärts von dem 3' – Ende eines Gens transkribiert , wie in Abbildung gezeigt 2A. Mit der Erkenntnis , dass die eukaryotische Genom es überwältigend Pervasive Transkription in Sinn sowie Antisense – Richtungen in und um ein Gen , 6, 7, 8, 9, 10, wurde bald klar zeigt , dass die traditionelle TRO – Test nicht , wenn die Polymerase – Signal erkennen kann stromabwärts eines Gens stellt einen Promotor initiierte Transkript (2A) oder eine anomale RNA , die som initiiertewhere in der Mitte des Gens , oder stromabwärts des Terminators Element (2B) oder der Polymerase – Transkription in der anti-sense – Richtung vom 3' – Ende des Gens (Figur 2C). Die strangspezifischen TRO-Assay unter Verwendung BrUTP hier beschriebenen unterscheiden, wenn die beobachtete Überlesen Polymerase Signal Promotor initiierte erweiterten Sinne mRNA oder ein Antisense-Transkript darstellt, die stromabwärts des Gens unter Prüfung eingeleitet. Wir haben diesen Ansatz erfolgreich verwendet in Bäckerhefe 2 die Rolle der Kin28 Kinase in Termination der Transkription zu demonstrieren. Der Einsatz der Ansatz hier zeigen wir , dass Rna14 für die Beendigung der Transkription von ASC1 in Bäckerhefe erforderlich ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die strangspezifischen TRO hier verwendete Protokoll wurde aus dem Protokoll für GRO-Seq (Global Run On-Sequenzierung) Analyse in Säugetierzellen 12 verwendet angepasst. Wir modifizierten erfolgreich das Protokoll in Bäckerhefe im Entstehen begriffenen Transkription zu studieren. Um insbesondere die Transkriptionsterminierungs Defekt zu analysieren, passten wir das Protokoll weiter, indem sie von der RNA-Hydrolyse Schritt befreien. Dies ermöglichte es uns, um speziell die volle Länge im Ents…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referenzen
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