We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Questo manoscritto descrive un protocollo per rilevare difetti trascrizione terminazione in vivo. Il protocollo TRO specifico filamento utilizzando BrUTP qui descritto è un potente approccio sperimentale per analizzare il difetto di terminazione della trascrizione in condizioni fisiologiche. Come il dosaggio TRO tradizionale, si basa sulla presenza di una polimerasi trascrizionalmente attivo oltre all'estremità 3 'del gene come indicatore di trascrizione terminazione difetti 1. Supera due principali problemi incontrati con il test TRO tradizionale. In primo luogo, esso può rilevare se la polimerasi lettura attraverso il segnale di terminazione è quello che ha avviato la trascrizione dal promotore-prossimale, o se è semplicemente rappresentando una polimerasi diffusamente trascrizione che ha avviato non specificamente da qualche nel corpo o 3 ' fine del gene. In secondo luogo, può distinguere se il segnale polimerasi trascrizionalmente attivo oltre laregione terminatore è veramente il translettura polimerasi senso mRNA di trascrizione o un segnale di RNA anti-senso non codificante terminator-iniziati. Brevemente, il protocollo prevede permeabilizzante le cellule di lievito in crescita esponenziale, permettendo ai trascritti che avviati in vivo di allungare in presenza del nucleotide BrUTP, purificare RNA BrUTP marcato dall'approccio affinità, trascrizione inversa del RNA nascente purificato e amplificando il cDNA usando primer specifici filamento che fiancheggiano il promotore e le regioni di terminazione del gene 2.
Il ciclo di trascrizione eucariotica si compone di tre fasi principali; iniziazione, l'allungamento e la terminazione. La terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II è costituito da due distinte fasi, interdipendenti 3. Il primo passo prevede la scissione, poliadenilazione e il rilascio di mRNA dal modello, ed è immediatamente seguita dalla seconda fase, segnata dal disimpegno della polimerasi dal modello. La corretta terminazione è di fondamentale importanza per il riciclaggio della polimerasi durante l'iniziazione / ripresa della trascrizione, per evitare l'interferenza con la trascrizione dei geni a valle, e per mantenere la trascrizione aberranti sotto controllo limitando trascrizione di pervasiva non codificante RNA 4, 5. Nonostante i recenti progressi, la risoluzione è di gran lunga il meno passo capito del ciclo di trascrizione RNA polimerasi II. Un test terminazione affidabile è essenziale per studiare il meccanismo underlying terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo.
Un certo numero di approcci sperimentali sono utilizzati per rilevare il difetto di terminazione in un gene trascrizione attivamente in condizioni fisiologiche. Questi includono Northern blot, fattore di terminazione Chip (immunoprecipitazione della cromatina) e il saggio TRO tradizionale. Ognuna di queste tecniche hanno alcuni vantaggi e svantaggi. Il saggio TRO tradizionali utilizzati per essere l'approccio più affidabile e sensibile per la rilevazione di un difetto di terminazione della trascrizione in vivo 1. Questo test localizza le molecole polimerasi trascrizionalmente attivi su diverse regioni di un gene all'interno della cella. In condizioni normali, il saggio dimostra molecole polimerasi trascrizionalmente impegnati rigorosamente distribuiti tra la regione promotore e terminatore del gene (Figura 1A). Alla cessazione difettoso, tuttavia, la polimerasi è in grado di leggere il segnale di terminazionee viene rilevato nella regione a valle del 'fine del gene (Figura 1B) 3.
Un difetto terminazione della trascrizione si manifesta in presenza di una polimerasi di senso trascrizione che ha avviato dalla regione promotore-prossimale, ed essere in grado di leggere il segnale di terminazione, continua trascrivere la regione a valle della estremità 3 'di un gene, come mostrato in figura 2A. Con la realizzazione che il genoma eucariotico presenta schiacciante trascrizione diffusa in senso così come le direzioni anti-senso e intorno a un gene 6, 7, 8, 9, 10, divenne presto chiaro che il saggio TRO tradizionale non può rilevare se il segnale polimerasi a valle di un gene rappresenta una trascrizione promotore-avviata (Figura 2A) o un RNA aberrante che ha avviato somewhere nel mezzo del gene oa valle dell'elemento terminatore (Figura 2B), o la trascrizione polimerasi in direzione anti-senso dall'estremità 3 'del gene (Figura 2C). Il dosaggio specifico TRO-strand utilizzando BrUTP qui descritto può distinguere se il segnale polimerasi translettura osservato rappresenta promotore-avviato mRNA senso esteso o un trascritto antisenso che ha avviato valle del gene in esame. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio per dimostrare il ruolo delle chinasi Kin28 a cessazione della trascrizione in erba di lievito 2. Utilizzando l'approccio qui dimostriamo che Rna14 è necessario per la terminazione della trascrizione di ASC1 in erba lievito.
Il protocollo specifica TRO-filo usato qui è stato adattato dal protocollo utilizzato per GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analisi in cellule di mammifero 12. Abbiamo modificato con successo il protocollo di studiare la trascrizione nascente in erba lievito. Per analizzare in particolare il difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo regolato il protocollo ulteriormente per sbarazzarsi della fase di RNA idrolisi. Questo ci ha permesso di rilevare in particolare la lunghezza trascrizion…
The authors have nothing to disclose.
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
CTP | N0454AA | ||
GTP | N0452AA | ||
Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |