Análise de terminação da transcrição Usando Approach (TRO) específico BrUTP vertente Transcrição Run-on
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
Este manuscrito descreve um protocolo para a detecção de defeito de transcrição de terminação in vivo. O protocolo de TRO específica de cadeia simples usando BrUTP descrito aqui é uma poderosa abordagem experimental para analisar o defeito de terminação da transcrição sob condições fisiológicas. Tal como o ensaio de TRO tradicional, baseia-se na presença de uma polimerase de transcricionalmente activos para além da extremidade 3 'do gene como um indicador de um defeito de transcrição de terminação 1. Ela supera dois principais problemas encontrados com o ensaio TRO tradicional. Em primeiro lugar, ele pode detectar se a polimerase de leitura através do sinal de terminação é a que iniciou a transcrição a partir da região do promotor proximal, ou se é simplesmente que representa uma polimerase pervasively transcrição que iniciou não especificamente a partir de um lugar no corpo ou a 3 ' terminal do gene. Em segundo lugar, pode distinguir se o sinal de polimerase transcricionalmente activo para além doa região do terminador é verdadeiramente a polimerase de ARNm transcrever readthrough sentido ou um sinal de ARN anti-sentido não codificante iniciou-terminador. Em resumo, o protocolo envolve a permeabilização das células de levedura em crescimento exponencial, permitindo que os transcritos que iniciados in vivo para alongar na presença do nucleótido BrUTP, purificando o RNA BrUTP marcado pela abordagem de afinidade, transcrição reversa do ARN nascente purificada e amplificando o cDNA usando iniciadores específicos de cadeia que flanqueiam a as regiões de terminação do gene promotor e 2.
Introduction
O ciclo de transcrição eucariótica consiste em três etapas principais; iniciação, alongamento e terminação. A terminação de transcrição por ARN-polimerase II consiste de dois distintos, passos 3 interdependentes. O primeiro passo envolve a clivagem, poliadenilação e de libertação de ARNm a partir do molde, e é imediatamente seguida por uma segunda etapa, marcada por desengate da polimerase a partir do modelo. Terminação adequada é crucial para a reciclagem da polimerase durante o início / reinício da transcrição, para evitar a interferência com a transcrição dos genes a jusante, e para manter a transcrição aberrante em cheque, limitando a transcrição de penetrante não codificante de ARN 4, 5. Apesar dos avanços recentes, a terminação é, de longe, o passo menos entendida do ciclo de transcrição de ARN polimerase II. Um ensaio fiável terminação é essencial para o estudo do mecanismo de underlying terminação da transcrição por ARN-polimerase II in vivo.
Um número de abordagens experimentais são utilizados para detectar o defeito um gene de terminação de transcrição de forma activa sob condições fisiológicas. Estes incluem Northern blot, Chip fator de terminação (imunoprecipitação da cromatina) e no ensaio de TRO tradicional. Cada uma destas técnicas tem algumas vantagens e desvantagens. O ensaio TRO tradicional costumava ser a abordagem mais confiável e sensível para a detecção de um defeito de terminação da transcrição in vivo 1. Este ensaio localiza as moléculas de polimerase transcricionalmente activos em diferentes regiões de um gene dentro da célula. Sob condições normais, o ensaio mostra moléculas de polimerase de transcrição engajadas rigorosamente distribuídas entre a região do promotor e terminador do gene (Figura 1A). Após o término com defeito, no entanto, a polimerase é incapaz de ler o sinal de terminaçãoe é detectado na região a jusante da extremidade 3 'do gene (Figura 1B).
Um defeito de terminação da transcrição é manifestada na presença de uma polimerase de sentido-transcrição que iniciada a partir da região do promotor proximal, e sendo incapaz de ler o sinal de terminação, continua a transcrição da região a jusante da extremidade 3 'de um gene, como mostrado na figura 2A. Com a constatação de que o genoma eucariota exibe a transcrição generalizada esmagadora no sentido, bem como indicações anti-senso e em torno de um gene 6, 7, 8, 9, 10, logo ficou claro que o ensaio TRO tradicional não pode detectar se o sinal de polimerase a jusante de um gene representa uma transcrição iniciada pelo promotor (Figura 2A) ou um ARN aberrante que iniciou Somewhere no meio do gene ou a jusante do elemento terminador (Figura 2B), ou a polimerase de transcrição no sentido anti-sentido a partir da extremidade 3 'do gene (Figura 2C). O ensaio específico de cadeia TRO usando BrUTP descrito aqui pode distinguir se o sinal de polimerase readthrough observada representa ARNm com sentido alargado iniciada pelo promotor ou um transcrito anti-sentido que iniciou a jusante do gene sob exame. Temos utilizado com sucesso esta abordagem para demonstrar o papel da Kin28 quinase na terminação da transcrição em brotamento levedura 2. Empregando a abordagem aqui vamos mostrar que Rna14 é necessária para a terminação da transcrição de ASC1 em brotamento levedura.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo TRO específica de cadeia usada aqui foi adaptado do protocolo utilizado para análise GRO-seq (Global Run On-Sequencing) em células de mamíferos 12. Nós com sucesso modificado o protocolo para estudar a transcrição nascente na brotação levedura. Para analisar especificamente o defeito terminação da transcrição, nós ajustamos o protocolo ainda mais por se livrar da etapa de hidrólise RNA. Isto permitiu-nos detectar especificamente o comprimento transcrições completas na…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referenzen
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