BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
Bu el yazması in vivo transkripsiyon sonlandırma kusuru tespit etmek için bir protokol tanımlamaktadır. kullanarak BrUTP Burada anlatılan iplikçik özgü TRO protokolü fizyolojik koşullar altında transkripsiyon sonlandırma kusuru analiz etmek için güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Geleneksel TRO tahlilinde olduğu gibi, bir transkripsiyon sonlandırma kusuru 1 bir göstergesi olarak genin 3 'ucunun ötesine, transkripsiyonal olarak aktif polimeraz varlığına dayanır. Geleneksel TRO testi ile karşılaştı iki büyük sorunlar üstesinden gelir. Birincisi, bu sonlandırma sinyalleri aracılığıyla okuma polimeraz promotör-proksimal bölgeden transkripsiyonu başlatılan biridir olmadığını algılamak, ya da basitçe bir yerde vücutta gelen non-spesifik olarak başlatılan yaygın bir transkripsiyonu polimeraz ya da 3 'temsil eğer genin sonu. İkinci olarak, ayırt eğer ötesinde transkripsiyonel olarak aktif polimeraz sinyalisonlandırıcı bölge gerçek okuma domeyni sens mRNA transkripsiyonu polimeraz ya da bir terminatör başlatılan kodlayıcı olmayan anti-sens RNA sinyalidir. Kısaca, protokol, katlanarak büyüyen maya hücrelerini geçirimli afinite yaklaşımla BrUTP etiketli RNA saflaştırılması, BrUTP nükleotid mevcudiyetinde ince uzun in vivo olarak başlatılan transkript izin içerir saflaştırılmış Yeni oluşan RNA transkripsiyonu ve cDNA amplifiye kullanılarak ters promoteri ve gen 2'nin sonlandırıcı bölgeleri çevreleyen tel-spesifik primerler.
Introduction
Ökaryotik transkripsiyon döngüsü üç ana adımdan oluşur; başlatma, uzama ve sonlanma. RNA polimeraz II transkripsiyonun sonlandırılması, iki farklı, birbirine Adım 3 oluşur. İlk adım, şablondan ayrılması, poliadenilasyonu ve mRNA'nm salınmasını içerir ve hemen şablondan polimerazın ayrılma ile işaretlenmiş, ikinci aşama takip eder. Uygun sonlandırma ve RNA 4, 5 kodlayıcı olmayan yaygın transkripsiyonunu sınırlayarak kontrol anormal transkripsiyonu tutmak için aşağı genlerin transkripsiyonu müdahaleyi önlemek için, transkripsiyon başlama / yeniden başlatılması sırasında polimeraz geri dönüşümü için hayati önem taşımaktadır. Son gelişmelere rağmen, fesih RNA polimeraz II transkripsiyon döngüsü çok az anlaşılan adım olduğunu. Güvenilir bir sonlandırma tahlil mekanizmasını underlyin eğitim için gerekli olanin vivo RNA polimeraz II tarafından transkripsiyon g sonlandırma.
Deneysel bir kısım yaklaşımlar, fizyolojik koşullar altında, bir aktif transkripsiyonu gen sonlandırma kusuru tespit etmek için kullanılır. Bunlar, Kuzey benek, fesih faktörü ChIP (Kromatin Immunoprecipitation) ve geleneksel TRO deneyini içerirler. Bu tekniklerin her biri bazı avantajları ve dezavantajları vardır. Kullanılan geleneksel TRO deney in vivo 1 bir transkripsiyon sonlandırma kusur tespiti için en güvenilir ve hassas bir yaklaşım olarak. Bu tahlil hücre içinde bir genin farklı bölgelerde transkripsiyonel olarak aktif polimeraz molekülleri lokalize. Normal koşullar altında, deney katı geni (Şekil 1A) promoter ve terminatör bölgesi arasında dağıtıldı transkripsiyonel kavranan polimeraz molekülleri gösterir. kusurlu sona ermesi üzerine, ancak, polimeraz sonlandırma sinyali okuyamıyorve gen (Şekil 1B) 3 'ucunun alt baş bölgesinde saptanır.
Bir transkripsiyon sonlandırma kusur promotör yakın bölgeden başlatılan duyu-transkripsiyon polimeraz mevcudiyetinde ortaya ve sonlandırma sinyali Okuyamamak olup, Şekil 'de gösterildiği gibi, bir genin 3' ucunun alt baş bölgesi transkripsiyonu devam Şekil 2A. Genom ve bir genin 6, 7, 8, 9, 10 civarında ezici yaygın anlamda transkripsiyonu yanı sıra anti-sens yön gösteren gerçekleştirilmesi, yakında geleneksel TRO tahlil algılayamaz belli oldu polimeraz sinyali ise bir genin bir teşvikçinin akış aşağısına başlatılan transkript (Şekil 2A) ya da som başlatılan anormal RNA temsilbir gen ya da terminatör elemanı (Şekil 2B) ya da genin (Şekil 2C) 3 'anti-sens yönünde polimeraz transkripsiyonu alt baş ortasına ewhere. gözlenen okuma domeyni polimeraz sinyal yükseltici tarafından başlatılan uzun sens mRNA veya inceleme konusu genin alt başlatılan bir anti-sens transkripti temsil ediyorsa kullanılarak BrUTP burada açıklanan şerit spesifik TRO deney ayırt edebilir. Biz başarıyla maya 2 tomurcuklanan transkripsiyon sonlandırılmasında Kin28 kinaz rolünü göstermek için bu yaklaşımı kullandık. Burada bir yaklaşımı uygulamak suretiyle Biz Rna14 maya tomurcuklanmasına ASC1 transkripsiyon sonlandırma için gerekli olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada kullanılan iplikçik özgü TRO protokolü memeli hücrelerinde 12 Gro-Sek (Global Run On-Sıralama) analiz için kullanılan protokol uyarlanmıştır. Biz başarıyla maya tomurcuklanan doğmakta olan transkripsiyonu incelemek için protokol güncellenmiştir. Özellikle transkripsiyon sonlandırma kusur analiz etmek, biz RNA hidroliz adımı kurtularak daha protokolü ayarlanır. Bu bize özellikle promotör bölgenin yakınında transkripsiyon başlangıç sitesinden başlatıla…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referenzen
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al. The reality of pervasive transcription. PLoS Biol. 9 (7), e1000625 (2011).
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
