Summary

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Published: August 04, 2017
doi:

Summary

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Abstract

Hydrogels worden erkend als veelbelovende materialen voor cel cultuur toepassingen vanwege hun vermogen om bieden zeer gehydrateerd cel omgevingen. Het gebied van 3D sjablonen stijgt als gevolg van de potentiële gelijkenis van die materialen naar de natuurlijke extracellulaire matrix. Hydrogels op basis van eiwitten zijn bijzonder veelbelovend, omdat ze gemakkelijk kunnen worden matiemaatschappij en gedefinieerde structuren met verstelbare fysisch-chemische eigenschappen kunnen bereiken. De productie van de 3D sjablonen macroporeuze voor cel cultuur toepassingen met behulp van natuurlijke materialen wordt echter vaak beperkt door hun zwakkere mechanische eigenschappen vergeleken met die van synthetische materialen. Hier, verschillende methoden werden geëvalueerd om te produceren macroporeuze bovien serumalbumine (BSA)-gebaseerde hydrogel systemen, met verstelbare porie formaten in het bereik van 10 tot en met 70 µm in straal. Bovendien is een methode voor het genereren van kanalen in dit materiaal op basis van eiwitten die verschillende honderd micron lange opgericht. De verschillende methoden voor de productie van poriën, evenals de invloed van poriegrootte op materiaaleigenschappen zoals zwelling verhouding, pH, temperatuur stabiliteit en enzymatische afbraak gedrag, werden geanalyseerd. Porie maten werden onderzocht in de native, gezwollen Braziliaanse deelstaat de hydrogels met behulp van confocale laser scanning microscopie. De haalbaarheid voor cel cultuur toepassingen werd geëvalueerd aan de hand van een cel-lijm RGD peptide wijziging van het systeem van eiwit en twee model cellijnen: menselijke borstkankercellen (A549) en adenocarcinomic menselijke alveolaire basale epitheliale cellen (MCF7).

Introduction

Hydrogels zijn materialen die vormen van onoplosbare 3D netwerken kunnen grote hoeveelheden water bindend. Dergelijke materialen bieden uitstekende omgevingsvoorwaarden voor levende cellen. Op dit moment, er is steeds meer belangstelling in de generatie van driedimensionale hydrogel structuren en de ontwikkeling van procédés voor het aanpassen van hun chemische en fysische eigenschappen. Zodra dit gebeurt, kan een sjabloon voor de groei van cellen en de manipulatie van cellulaire gedrag gegenereerde1,2,3,4. Deze 3D structuren niet alleen maakt een meer natuurlijke en realistische omgeving dan conventionele tweedimensionale benaderingen, maar ze ook onthullen nieuwe mogelijkheden voor de groei van stamcellen of tumor5modellen. Verschillende materialen bezitten een aantal kenmerken die vooral afhankelijk zijn van de poriegrootte van het gel-6. De poriën spelen een cruciale rol in de gestuurde groei van stamcellen cel cultuur toepassingen en weefselkweek. Bijvoorbeeld, zuurstof en voedingsstoffen verspreiden via de matrix, en voldoende hoeveelheden moeten kunnen bereiken van de cellen7. Aan de andere kant, schadelijke metabolieten moeten zo spoedig mogelijk worden verwijderd, en moet voldoende ruimte bieden voor celgroei beschikbaar7. Bijgevolg beïnvloeden de eigenschappen van het materiaal, en dus de poriegrootte, ernstig de potentiële voordelen en mogelijke toepassingen van de matrix. Afhankelijk van de eigenschappen van het materiaal, kunnen verschillende celgroei processen optreden in de 3D-celkweek, met inbegrip van de vorming van neuronale structuren; de groei en differentiatie van huid of bot cellen; en de gestuurde groei van speciale stamcellijnen, zoals hepatocyten of fibroblasten2,3,8,9,10,11. Een ander cruciaal punt beïnvloeden de eventuele toepassing van een materiaal, is zijn stabiliteit naar externe prikkels12. Bijvoorbeeld, moet de hydrogel zijn mechanische integriteit in cel voedingsbodems of het menselijk lichaam.

In de afgelopen jaren onderzoek naar 3D cel cultuur hydrogels geïntensiveerd, en vele studies werden uitgevoerd om te lossen van de 3D-platforms van de systemen-13. Hydrogels bestaat uit chemisch gesynthetiseerde onderdelen zijn meestal onderzocht omdat zij kunnen gemakkelijk gesynthetiseerd en chemisch bewerkt en ze vertonen een hoge stabiliteit (Zie Zhu et al., 2011 herzieningsverzoek)5. Eiwitten hebben echter vele heilzame eigenschappen: als zogenaamde “precisie polymeren,” ze zijn biocompatibel; ze hebben een gedefinieerde lengte; ze zijn relatief makkelijk te wijzigen; en ze hebben een groot aantal doel sites14,15. In dit opzicht kunnen zeer specifieke, innovatieve structuren worden gegenereerd voor toepassing op vele terreinen. In deze studie werd een op basis van eiwitten hydrogel16 gebruikt om aan te tonen van het vermogen van gevestigde methoden om de invloed van de 3D-architectuur van het materiaal. Bovendien, het vermogen en de toepasbaarheid op porie generatie werd eveneens onderzocht.

Veel verschillende technieken zijn beschikbaar voor het wijzigen van 3D-structuren, met inbegrip van zowel eenvoudige methoden en geavanceerde, zeer gespecialiseerde technieken uit verschillende gebieden van de materiaalkunde. Een wijdverbreide techniek is het gebruik van electrospinning voor het genereren van welomschreven structuren17. Geladen vezels zijn getrokken uit een oplossing door een elektrisch veld en vervolgens stollen bij blootstelling aan zuurstof. Op deze manier kunnen de vezels in de range van verschillende nanometer tot verschillende micron worden geproduceerd. Additionele technieken om af te stemmen op de grootte, structuur en verdeling van de poriën in de matrix zijn zachte lithografie fotolithografie, hydrodynamische gericht, electro-spuiten, en bio-afdrukken18,19,20. Een belangrijk nadeel van deze technieken is hun afhankelijkheid op specifieke en dure apparatuur en speciale chemische stoffen of materialen. Bovendien ervaring met deze technieken is vaak niet direct overdraagbaar naar materialen op basis van eiwitten, en veel van de chemicaliën en de methoden zijn niet cel compatibel.

Aan de andere kant, vertrouw veel technieken niet op speciale apparatuur, waardoor ze gemakkelijker en goedkoper om toe te passen en te reproduceren. Een wijdverbreide methode voor structuur manipulatie is oplosmiddel gieten21,22,23. Deeltjes zijn toegevoegd voordat de polymerisatie-reactie en homogeen worden verdeeld om te verzadigen van de oplossing. Na de polymerisatie leidt een verandering van omstandigheden, zoals een verdunning of een verandering van de pH, tot het oplossen van de deeltjes, terwijl de poriën binnen het materiaal blijven. De chemicaliën die worden gebruikt in deze technieken, zoals zout, suiker, paraffine, gelatine en krijt, zijn goedkoop en gemakkelijk beschikbaar. In het vriesdrogen, zijn gezwollen hydrogels bevroren. De daaropvolgende sublimatie van de vloeibare fasen onder een vacuüm is dan23,24,25uitgevoerd. Water sublimatie van het netwerk is zacht genoeg om de specifieke 3D structuren van het materiaal. In het gas wordt schuimvorming, wordt een oplossing gestreamd met een gas terwijl de polymerisatie plaats vindt, waardoor poriën binnen de gel-21. De grootte en de verdeling van de poriën kunnen worden aangepast afhankelijk van de gasstroom.

Om de eiwit hydrogel, is BSA reageerde met tetrakis (hydroxymethyl) fosfonium chloride (THPC) in een Mannich-type reactie te voorzien in de vorming van covalente bindingen tussen primaire amines en de hydroxy groepen van de vier-armige linker molecuul26. Mogelijk schadelijke tussenproducten worden verwijderd door overmatig wassen van het materiaal na de reactie optreedt.

Deze studie toont aan dat de mogelijkheid van het behandelen van een BSA gebaseerde materiaal met verschillende technieken om te manipuleren en aanpassen van de grootte van de poriën. Elk van de technieken kan worden gebruikt in elk laboratorium wereldwijd, zoals er geen speciale apparatuur nodig is. Bovendien verschillende parameters, zoals zwelling verhouding, enzymatische afbraak, stabiliteit van de pH en temperatuur gevoeligheid, zijn onderzocht en met elkaar vergeleken, met name de eerbiediging op de invloed van de verschillende technieken op de generatie van 3D platforms. De materialen werden ten slotte matiemaatschappij met cel-lijm peptiden te onderzoeken van de eventuele toepassing van de materialen op de cultuur van de cel. Twee verschillende model-cellijnen werden gebruikt: A549 en MCF7.

Protocol

1. Hydrogel voorbereiding Meng 200 mg BSA met 1 mL gedeïoniseerd H2O maken 20% (m/v) BSA voorraad (stock oplossing A). Mix-165 µL van THPC oplossing (134 mg/mL) met gedeïoniseerd water maken THPC 4.835 mL stockoplossing (stockoplossing B). Weeg 1 mg KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) peptide (of een gelijkwaardige cel-lijm-peptide) en Verdun het in 100 µL van steriele H2O te verkrijgen van een oplossing van 10 mg/mL (stockoplossing C).Opmerking: Deze stap is optionee…

Representative Results

Hydrogel development has become one of the most prominent fields in material research-related biological studies, with thousands of entries indexed in scientific research archives. Although the behavior of many systems is well studied, the manipulation of 3D networks, especially of sensitive protein-based materials, is often a major issue in material science. Another commonly underestimated challenge is the correct measurement of the native structure of a material using cryo electron micr…

Discussion

The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank Baden-Württemberg, Stiftung voor hun financiële steun in het kader van de “Bioinspired materiaal synthese” (BioMatS-14).

Materials

Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8 %, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1 % Triton X 100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7 % Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2,  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8 %, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1,5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

Referenzen

  1. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
  2. Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
  3. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  4. Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
  5. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
  6. Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
  7. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
  8. Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
  9. Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
  10. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
  11. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  12. Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
  13. Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
  14. Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
  15. Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
  16. Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
  17. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  18. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
  19. Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
  20. Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
  21. Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
  22. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  23. Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
  24. Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
  25. Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
  26. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
  27. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
  28. Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
  29. Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
  30. Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
  31. Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
  32. Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
  33. Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
  34. Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
check_url/de/55813?article_type=t

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

View Video