Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen
Summary
Verschiedene Methoden zu manipulieren, dreidimensionalen Architektur in Protein-basierte Hydrogele werden hier in Bezug auf die Materialeigenschaften ausgewertet. Die makroporöse Netze sind mit einer Zelle-Klebstoff-Peptid funktionalisiert und deren Umsetzbarkeit in der Zellkultur wird ausgewertet, mit zwei verschiedenen Modell-Zelllinien.
Abstract
Hydrogele sind anerkannte vielversprechende Materialien für Zelle Kultur Anwendungen aufgrund ihrer Fähigkeit, stark hydratisiert Zelle Umgebungen bereitzustellen. Bereich der 3D Vorlagen steigt wegen der möglichen Ähnlichkeit dieser Materialien, die natürliche extrazelluläre Matrix. Protein-basierte Hydrogele sind besonders Erfolg versprechend, weil sie leicht funktionalisiert können und definierte Strukturen mit einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften erreichen können. Allerdings ist die Produktion von makroporösen 3D Vorlagen für die Zelle Kultur Anwendungen mit natürlichen Materialien oft durch ihre schwächeren mechanische Eigenschaften im Vergleich zu synthetischen Materialien begrenzt. Hier wurden verschiedene Methoden ausgewertet, um makroporöse Rinderserumalbumin (BSA) produzieren-basierte Hydrogel-Systeme mit einstellbare Porengrößen im Bereich von 10 bis 70 µm im Umkreis. Darüber hinaus wurde eine Methode zur Erzeugung Kanäle in diesem Protein-basierten Material, das mehrere hundert Mikrometer lang sind. Die verschiedenen Methoden, Poren, sowie den Einfluss der Porengröße auf Materialeigenschaften wie Schwellungen, Verhältnis, pH-Wert, Temperaturstabilität und enzymatischen Abbau Verhalten, produzieren wurden analysiert. Porengrößen wurden im native, geschwollene Bundesstaat die Hydrogele mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie untersucht. Die Machbarkeit für Zelle Kultur Anwendungen wurde eine Zelle-Klebstoff RGD Peptid Modifikation des Systems der Protein und zwei Modell-Zelllinien bewertet: menschlichen Brustkrebszellen (A549) und adenocarcinomic menschlichen alveoläre basalen Epithelzellen (MCF7).
Introduction
Hydrogele sind Materialien, die bilden unlösliche 3D Netzwerke in der Lage, große Mengen an Wasser zu binden. Solche Materialien bieten hervorragende Bedingungen für lebende Zellen. Derzeit, steigt es Interesse bei der Erzeugung von dreidimensionalen Hydrogel Strukturen und der Entwicklung von Prozessen, deren chemischen und physikalischen Eigenschaften anzupassen. Sobald dies erreicht ist, kann eine Vorlage für das Wachstum von Zellen und die Manipulation von zellulären Verhalten generierte1,2,3,4. Diese 3D Strukturen schaffen nicht nur eine natürlichere und realistische Umgebung als herkömmlichen zweidimensionalen Ansätze, aber sie auch zeigen neue Möglichkeiten für das Wachstum von Stammzellen oder Tumor Modelle5. Unterschiedliche Materialien besitzen eine Reihe von Eigenschaften, die vor allem von der Porengröße des Gel6abhängen. Die Poren spielen eine entscheidende Rolle in Zelle Kultur Anwendungen, Gewebe-Engineering und das gerichtete Wachstum von Stammzellen. Beispielsweise mit Sauerstoff und Nährstoffen durch die Matrix diffundieren und ausreichende Mengen müssen möglicherweise die Zellen7zu erreichen. Auf der anderen Seite schädliche Stoffwechselprodukte müssen so schnell wie möglich entfernt werden, und ausreichend Platz für das Zellwachstum muss7verfügbar sein. Daher beeinflussen die Eigenschaften des Materials und somit die Porengröße stark nutzen und mögliche Einsatzmöglichkeiten der Matrix. Abhängig von den Eigenschaften des Materials, können verschiedene Zellwachstum Prozesse in 3D Zellkultur, einschließlich der Bildung von neuronalen Strukturen auftreten; das Wachstum und die Differenzierung von Zellen der Haut oder Knochen; und das gerichtete Wachstum der spezielle Zelllinien, wie Hepatozyten oder Fibroblasten2,3,8,9,10,11. Ein weiterer entscheidender Punkt Einfluss auf die mögliche Anwendung eines Materials ist seine Stabilität gegen äußere Reize12. Zum Beispiel muss das Hydrogel seine mechanische Integrität in Zellkulturmedien oder den menschlichen Körper pflegen.
In den letzten Jahren auf 3D Zelle Kultur Hydrogele intensiviert Forschung und zahlreiche Studien wurden durchgeführt, um die 3D Architekturen der Systeme13zu beheben. Hydrogele bestehend aus chemisch synthetisierten Komponenten sind am häufigsten untersucht, weil sie leicht synthetisiert und chemisch modifiziert werden können und sie hohen Stabilität weisen (siehe Zhu Et Al., 2011 eine Überprüfung)5. Proteine haben jedoch viele positive Eigenschaften: als so genannte “Präzision Polymere,” sie sind biokompatible; Sie haben eine definierte Länge; Sie sind relativ leicht zu ändern; und sie haben eine große Anzahl von Ziel-Websites14,15. In diesem Zusammenhang können hochspezifische, innovative Strukturen für den Einsatz in vielen Bereichen generiert werden. In dieser Studie wurde ein Protein-basierten Hydrogel-16 verwendet, zu zeigen, die Fähigkeit der etablierten Methoden 3D-Architektur des Materials zu beeinflussen. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit und die Anwendbarkeit zu Pore Generation auch untersucht.
Viele verschiedene Techniken stehen zur Verfügung, 3D Strukturen, einschließlich einfache Methoden und anspruchsvolle, hochspezialisierte Techniken aus verschiedenen Bereichen der materiellen Wissenschaft zu ändern. Eine weit verbreitete Technik ist die Verwendung von Elektrospinnen, klar definierte Strukturen17zu generieren. Geladene Fasern werden aus einer Lösung durch ein elektrisches Feld gezogen und dann nach Einwirkung von Sauerstoff zu festigen. Auf diese Weise können Fasern im Bereich von einigen Nanometern bis zu mehreren Mikrometern hergestellt werden. Zusätzliche Techniken, um die Größe, Struktur und Verteilung der Poren innerhalb der Matrix zu optimieren sind weiche Lithographie, Photolithographie, hydrodynamische Fokussierung, Elektro-Spritzen und Bio-Druck18,19,20. Ein erheblicher Nachteil dieser Techniken ist ihre Abhängigkeit von bestimmten, teure Ausrüstung und spezielle Chemikalien oder Materialien. Darüber hinaus Erfahrung mit diesen Techniken ist oft nicht direkt übertragbar auf Protein-basierten Materialien, und viele der Chemikalien und Methoden sind nicht kompatibel.
Auf der anderen Seite verlassen viele Techniken sich nicht auf spezielle Ausrüstung, so dass sie einfacher und billiger zu bewerben und zu reproduzieren. Eine weit verbreitete Methode zur Struktur Manipulation ist solvent Casting21,22,23. Partikel werden vor der Polymerisationsreaktion hinzugefügt und sind homogen verteilt, um die Lösung zu sättigen. Nach der Polymerisation führt eine Änderung der Bedingungen, wie eine Verdünnung oder eine pH-Wert-Änderung zu der Solvatation der Teilchen, während die Poren im Material bleiben. Die in diesen Techniken, wie Salz, Zucker, Paraffin, Gelatine und Kreide, verwendeten Chemikalien sind billig und überall verfügbar. Gefriertrocknung, sind geschwollene Hydrogele eingefroren. Die nachfolgenden Sublimierung der flüssigen Phasen unter Vakuum wird dann23,24,25durchgeführt. Wasser Sublimation aus dem Netzwerk ist sanft genug, um die spezifische 3D Strukturen des Materials beibehalten. Im Gas Schäumen ist eine Lösung mit einem Gas strömte, während die Polymerisation erfolgt, Poren im Gel21verlassen. Umfang und Verteilung der Poren können je nach dem Gasstrom eingestellt werden.
Um die Protein-Hydrogel zu bilden, wird BSA mit Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC) in einer Mannich-Typ-Reaktion ermöglicht die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen primären Aminen und die Hydroxygruppen der vierarmigen Linker Molekül26reagiert. Mögliche schädliche Zwischenprodukte werden durch übermäßiges Waschen des Materials entfernt, nachdem die Reaktion auftritt.
Diese Studie zeigt die Möglichkeit der Behandlung von einem BSA-basierte Material mit verschiedenen Techniken zu manipulieren und passen Sie die Größe der Poren. Jede der Techniken kann verwendet werden in jedem Labor weltweit, da keine besondere Ausrüstung notwendig ist. Darüber hinaus respektieren wie Schwellung Verhältnis, enzymatische Abbaubarkeit, pH-Stabilität und Temperaturempfindlichkeit, wurden untersucht und im Vergleich zu anderen, verschiedene Parameter, vor allem auf den Einfluss der verschiedenen Techniken auf die Erzeugung von 3D-Architekturen. Zu guter Letzt wurden die Materialien mit Zelle-Klebstoff Peptide zu untersuchen, die mögliche Anwendung der Materialien auf Zellkultur funktionalisiert. Zwei verschiedene Modell-Zell-Linien wurden verwendet: A549 und MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Baden-Württemberg Stiftung danken für ihre finanzielle Unterstützung im Rahmen “Muskelmodelle Material Synthese” (BioMatS-14).
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
Referenzen
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
