Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula
Summary
Diferentes métodos para manipular arquitectura tridimensional en Hidrogeles basados en proteína se evalúan aquí con respecto a las propiedades del material. Las redes macroporoso son funcionalizadas con un péptido de la célula-adhesivo, y se evalúa su viabilidad en cultivo de células utilizando dos líneas celulares de diferentes modelos.
Abstract
Los hidrogeles son reconocidos como prometedores materiales para aplicaciones en cultura celular debido a su capacidad para proporcionar entornos celulares altamente hidratada. El campo de plantillas 3D está aumentando debido a la semejanza potencial de esos materiales a la matriz extracelular natural. Hidrogeles basados en proteína son particularmente prometedoras porque fácilmente puede ser funcionalizados y puede alcanzar estructuras definidas con propiedades fisicoquímicas ajustables. Sin embargo, la producción de plantillas 3D macroporoso para los usos de la cultura de célula utilizando materiales naturales a menudo está limitada por sus propiedades mecánicas más débiles comparados con los de materiales sintéticos. Aquí, se evaluaron diferentes métodos para producir macroporoso albúmina de suero bovino (BSA)-basado en sistemas de hidrogel, con tamaños de poro ajustable en el rango de 10 a 70 μm de radio. Además, se estableció un método para generar canales de este material basado en proteína que son varias cien micras de largo. Se analizaron los diferentes métodos para producir los poros, así como la influencia del tamaño de poro en material propiedades tales como relación, pH, estabilidad de la temperatura y el comportamiento de la degradación enzimática, la hinchazón. Tamaños de poro se investigaron en el estado nativo, hinchado de los hidrogeles mediante microscopía de láser confocal. La factibilidad de usos de la cultura de célula fue evaluada usando una pegamento celular RGD péptido modificación del sistema de proteína y dos líneas de celular modelo: células de cáncer de mama humano (A549) y adenocarcinomic alveolares basals epitelial las células humanas (MCF7).
Introduction
Los hidrogeles son materiales que forman redes 3D insolubles capaces de atar grandes cantidades de agua. Este tipo de materiales puede proporcionar excelentes condiciones ambientales para las células vivas. Actualmente, existe un creciente interés en la generación de estructuras tridimensionales de hidrogel y en el desarrollo de los procesos para adaptar sus propiedades químicas y físicas. Una vez que esto se logra, una plantilla para el crecimiento de las células y la manipulación del comportamiento celular puede ser generado1,2,3,4. Estas estructuras 3D no sólo crean un ambiente más natural y realista que los enfoques convencionales de dos dimensiones, pero también revelan nuevas posibilidades para el crecimiento de las células madre o tumor modelos5. Diferentes materiales poseen una serie de características que dependen principalmente del tamaño del poro del gel6. Los poros juegan un papel crucial en aplicaciones de cultivo celular, ingeniería de tejidos y el crecimiento dirigido de células madre. Por ejemplo, el oxígeno y los nutrientes difunden a través de la matriz, y cantidades adecuadas deben ser capaces de llegar a las células7. Por otro lado, metabolitos nocivos deben eliminarse lo antes posible, y espacio suficiente para el crecimiento de la célula debe estar disponible7. En consecuencia, las propiedades del material y por lo tanto el tamaño del poro, influyen severamente las posibles beneficio y posibles aplicaciones de la matriz. Dependiendo de las propiedades de los materiales, procesos de crecimiento de la célula diferentes pueden ocurrir en cultura celular 3D, incluyendo la formación de estructuras neuronales; el crecimiento y la diferenciación de las células de la piel o el hueso; y el crecimiento dirigido de líneas celulares especiales, como los hepatocitos o fibroblastos2,3,8,9,10,11. Otro de los puntos crucial que influyen en la posible aplicación de un material es su estabilidad hacia estímulos externos12. Por ejemplo, el hidrogel debe mantener su integridad mecánica en medios de cultivo celular o en el cuerpo humano.
En los últimos años de investigación en 3D de la célula cultura hidrogeles se intensificó, y se llevaron a cabo muchos estudios para resolver la arquitectura 3D de los sistemas13. Hidrogeles compuestos de componentes químicamente sintetizados comúnmente son investigados porque pueden ser sintetizados fácilmente y modificar químicamente y exhiben alta estabilidad (véase Zhu et al., 2011 una revisión)5. Sin embargo, las proteínas tienen muchas propiedades beneficiosas: como supuesto “polímeros de precisión”, son biocompatibles; tienen una longitud definida; son relativamente fáciles de modificar; y tienen un gran número de sitios de destino14,15. En este sentido, se pueden generar estructuras altamente específicas, innovadoras para su aplicación en muchos campos. En este estudio, un hidrogel basado en proteína16 fue utilizado para demostrar la capacidad de métodos bien establecidos para influir en la arquitectura 3D del material. Además, también se investigó la capacidad de y la aplicabilidad a la generación de poro.
Existen muchas técnicas diferentes modificar estructuras 3D, incluyendo métodos sencillos y técnicas sofisticadas y altamente especializadas de diversos campos de la ciencia de los materiales. Una técnica generalizada es el uso de electrospinning para generar estructuras bien definidas17. Cargada fibras se tiran de una solución por un campo eléctrico y luego solidifican con la exposición al oxígeno. De esta manera, se pueden producir las fibras en la gama de varios nanómetros hasta varias micras. Técnicas adicionales para ajustar el tamaño, estructura y distribución de los poros dentro de la matriz son la litografía blanda, Fotolitografía, enfoque hidrodinámico, electro-rociado y bio-impresión18,19,20. Un inconveniente importante de estas técnicas es su dependencia de equipos específicos, caros y productos químicos especiales o materiales. Además, experiencia con estas técnicas a menudo no es directamente transferible a los materiales basados en proteína, y muchos de los productos químicos y métodos no son compatibles la célula.
Por otra parte, muchas de las técnicas no se apoyan en equipos especiales, haciéndolos más fácil y más barato aplicar y reproducir. Un método generalizado para la manipulación de la estructura es de fundición solvente21,22,23. Las partículas se agregan antes de la reacción de polimerización y se distribuyen de forma homogénea para saturar la solución. Después de la polimerización, un cambio de condiciones, como una disolución o un cambio de pH, conduce a la solvatación de las partículas, mientras que los poros permanecen dentro del material. Los productos químicos utilizados en estas técnicas, tales como sal, azúcar, parafina, gelatina y tiza, son baratos y fácilmente disponibles. En la liofilización, son congelados hidrogeles hinchados. La sublimación posterior de las fases líquidas bajo un vacío es entonces realizado23,24,25. La sublimación del agua de la red es lo suficientemente suave para mantener las estructuras 3D específicas del material. En el gas que hace espuma, una solución es transmitida con un gas mientras que la polimerización ocurre, dejando poros en el gel de21. El tamaño y la distribución de los poros pueden ajustarse dependiendo de la corriente del gas.
Para formar el proteína del hidrogel, BSA está reaccionada cloruradas tetrakis (hidroximetil) fosfonio (THPC) en una reacción tipo Mannich para permitir la formación de enlaces covalentes entre aminas primarias y los grupos hidroxilo de la molécula de vinculador de cuatro brazos26. Posibles productos intermedios nocivos se eliminan por lavado excesivo del material después de que la reacción ocurra.
Este estudio demuestra la posibilidad de tratar un material a base de BSA con diversas técnicas para manipular y adaptar el tamaño de los poros. Cada una de las técnicas puede utilizarse en cualquier laboratorio a nivel mundial, ya que ningún equipo especial es necesario. Además, diferentes parámetros, tales como relación de hinchazón, degradabilidad enzimática, estabilidad de pH y sensibilidad de la temperatura, fueron examinados y comparados con otras, especialmente respetan a la influencia de las diferentes técnicas en la generación de arquitecturas de 3D. Por último, los materiales fueron funcionalizados con péptidos de célula-adhesivo para investigar la posible aplicación de los materiales para cultivo celular. Se utilizaron dos líneas celulares de diferentes modelos: A549 y MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Baden-Württemberg Stiftung por su apoyo financiero en el marco de la “Síntesis de materiales Bioinspirados” (biomantos-14).
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
Referenzen
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
