טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא
Summary
שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.
Abstract
Hydrogels מזוהים כחומרי מבטיח ליישומים תרבות תא, בשל היכולת שלהם לספק סביבות תא רטוב מאוד. בתחום תבניות תלת-ממד עולה בשל הדמיון פוטנציאלי של החומרים האלה מטריצה חוץ-תאית טבעיים. Hydrogels חלבון מבוססת מבטיחים במיוחד כי הם יכולים בקלות להיות functionalized ולא ניתן להשיג מבנים המוגדרים עם מאפיינים physicochemical מתכווננת. עם זאת, ייצור תבניות תלת-ממד macroporous ליישומים התרבות תאים, תוך שימוש בחומרים טבעיים לעיתים קרובות מוגבל על ידי שלהם תכונות מכניות חלש יותר בהשוואה לאלו של חומרים סינתטיים. . הנה, הוערכו שיטות שונות כדי לייצר macroporous אלבומין שור (BSA)-מבוסס מערכות הידרוג, עם גדלים נקבובית מתכווננת בטווח של 10-70 מיקרומטר ברדיוס. יתרה מזאת, שיטה להפקת ערוצי בחומר זה חלבון מבוססת כי הם כמה מאות מיקרונים ארוך הוקמה. השיטות השונות כדי לייצר את הנקבוביות, כמו גם את השפעת גודל הנקבוביות על תכונות חומר כגון נפיחות יחס, pH, יציבות טמפרטורה, בהתנהגות השפלה אנזימטיות, נותחו. גודל הנקבוביות נחקרו במדינת מקומיים, נפוחות של hydrogels באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. הכדאיות ליישומים תרבות תא הוערך באמצעות שינוי פפטיד תא-דבק RGD של המערכת חלבון, שתי שורות תאים דגם: תאי סרטן השד אנושי (A549) ו- adenocarcinomic האנושי מכתשי הבזליים בתאי אפיתל (MCF7).
Introduction
Hydrogels הם חומרים היוצרים לא מסיסים רשתות 3D מסוגל מחייב כמויות גדולות של מים. חומרים כאלה יכולים לספק תנאים סביבתיים מעולים עבור תאים חיים. כיום, שם הוא הגדלת עניין דור של מבנים תלת מימדיים הידרוג בהתפתחות תהליכים כדי להתאים שלהם מאפיינים כימיים ופיזיים. ברגע זו מושגת, תבנית עבור הצמיחה של תאים, המניפולציה של התנהגות הסלולר יכול להיות שנוצר1,2,3,4. אלה מבנים תלת-ממד לא רק ליצור סביבה יותר טבעי ומציאותי יותר גישות קונבנציונליות דו מימדי, אבל הם גם לחשוף בפניך אפשרויות חדשות לצמיחה של תאי גזע או גידול מודלים5. חומרים שונים בעלי טווח של מאפיינים התלויים בעיקר גודל הנקבוביות של ג’ל6. הנקבוביות לשחק תפקיד מכריע תא תרבות יישומים, הנדסת רקמות, וגידול מכוונת של תאי גזע. לדוגמה, חמצן וחומרים מזינים מפוזרת באמצעות המטריקס, ועל כמות מספקת להיות מסוגל להגיע את התאים7. מצד שני, מטבוליטים מזיקות להסירו מהר ככל האפשר, ועל די שטח עבור גדילת התאים להיות זמין7. כתוצאה מכך, המאפיינים של החומר, ובכך גודל הנקבוביות, להשפיע באופן חמור על יישומים אפשריים של האפשר והתועלת של המטריקס. תהליכי צמיחת תאים שונים בהתאם המאפיינים של החומר, יכול להתרחש תרבית תאים תלת-ממד, כולל הקמת מבנים עצביים; הצמיחה ואת התמיינות של תאים בעור או עצם; וגידול בבימויו של שורות תאי גזע מיוחד, כמו hepatocytes או fibroblasts2,3,8,9,10,11. עוד נקודה מכרעת המשפיעים על יישום אפשרי של חומר היא יציבותו כלפי גירויים חיצוניים12. לדוגמה, הידרוג חייב לשמור על שלמותה מכני תא תרבות בתקשורת או על גוף האדם.
בשנים האחרונות, מחקר על hydrogels תרבות תלת התא התעצמה, מחקרים רבים בוצעו כדי לפתור את ארכיטקטורות תלת-ממד של מערכות13. Hydrogels מורכב מרכיבים מסונתז כימית נחקרות הנפוץ ביותר כי הם יכולים להיות בקלות מסונתז והוא כימי ששינה שהם מייצגים את יציבות גבוהה (ראה ז’ו. et al., 2011 לסקירה)5. עם זאת, חלבונים יש תכונות מועילות רבות: כמו מה שנקרא “דיוק פולימרים,” הם מסתיימים; יש להם באורך מוגדר; הם קלים יחסית לשינוי; . ויש להם מספר רב של היעד אתרים14,15. בהקשר זה, ניתן להפיק ספציפי מאוד, חדשני מבנים עבור יישום בתחומים רבים. במחקר זה, המבוסס על חלבון הידרוג16 שימש להפגין את היכולת של שיטות ומבוססת להשפיע על הארכיטקטורה תלת-ממד של החומר. יתר על כן, היכולת של ותחולה לדור נקבובית גם נחקר.
טכניקות רבות זמינות לשנות מבנים תלת-ממד, כולל שיטות פשוטות והן בטכניקות מתוחכם, מאוד מיוחדים מתחומים שונים של חומר מדעי. טכניקה נפוצה היא השימוש electrospinning כדי ליצור מבנים מוגדרים היטב17. סיבי טעונה נשלפות מקבוצת פתרון על ידי שדה חשמלי, ואז לחזק עם חשיפה לחמצן. בדרך זו, יכול להיות מיוצר סיבי בטווח של ננומטרים עד מספר מיקרונים. שיטות נוספות לכוון את גודל המבנה, הפצה של הנקבוביות בתוך המטריצה הם הדפס אבן רכה, פוטוליתוגרפיה, מיקוד hydrodynamic, אלקטרו ריסוס, ביו-הדפסה18,19,20. חיסרון משמעותי של טכניקות אלה הוא התלות שלהם על ציוד ספציפי, יקר ולא בחומרים כימיים מיוחדים או חומרים. יתר על כן, ניסיון עם טכניקות אלה הוא לעתים קרובות לא להעברה ישירות חומרים מבוססי חלבונים, רבים של כימיקלים והשיטות אינם תא תואם.
מצד שני, טכניקות רבות אין לסמוך על ציוד מיוחד, שהופך אותם קל וזול כדי להחיל ולאחר להתרבות. שיטה נפוצה עבור מבנה מניפולציה הוא הליהוק הממס21,22,23. חלקיקים נוספים לפני התגובה הפילמור ומופצים למשל כדי להרוות את הפתרון. לאחר הפילמור, שינוי של תנאי לדילול או שינוי pH, מוביל יוצרות של החלקיקים, בעוד הנקבוביות להישאר בתוך החומר. הכימיקלים שמשתמשים בהם בטכניקות אלו, כגון מלח, סוכר, פרפין, ג’לטין, גיר, הם זול וזמין. ב ליופיליזציה, hydrogels נפוחות מוקפאים. סובלימציה עוקבות של השלבים נוזלי תחת ואקום הוא ואז לבצע24,23,25. סובלימציה מים מן הרשת הוא עדין מספיק כדי לשמור על המבנים תלת-ממד מסוים של החומר. גז קצף, פתרון זרמו עם גז, ואילו הפילמור מתרחש, עוזב את הנקבוביות בתוך ג’ל21. ניתן להתאים את גודל ואת ההפצה של הנקבוביות בהתאם זרם הגז.
כדי ליצור את הידרוג חלבון, BSA היא הגיבה כלוריד phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) (THPC) בתגובה Mannich-סוג כדי לאפשר היווצרות קשרים הדדיים בין אמינים ראשי הקבוצות הידרוקסי של מולקולה ארבע חמוש מקשר26. אפשרי intermediates מזיקים יוסרו על ידי שטיפה מוגזמת של החומר לאחר התגובה מתרחשת.
מחקר זה מדגים את האפשרות לטיפול חומר מבוסס-BSA עם טכניקות שונות כדי לשנות, להתאים את גודל הנקבוביות. כל אחת מהטכניקות יכול לשמש במעבדה כל ברחבי העולם, אין ציוד מיוחד הכרחי. בנוסף, פרמטרים שונים, כגון יחס נפיחות degradability אנזימטיות, pH ויציבות הטמפרטורה רגישות, היו בחן, לעומת אחד את השני, במיוחד מכבדים להשפעתם של הטכניקות השונות על הדור של ארכיטקטורות תלת-ממד. לבסוף, החומרים היו functionalized עם תא-דבק פפטידים לחקור אפשרי ליישום חומרי תרבית תאים. שתי שורות תאים מודל שונה שימשו: A549 ו- MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות באדן-וירטמברג Stiftung לתמיכה הפיננסית שלהם במסגרת “סינתזה חומר Bioinspired” (BioMatS-14).
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
Referenzen
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
