تصوير يعيش خلية من الخلايا الفطرية للتحقيق في أوضاع الدخول والتعريب سوبسيلولار من ديفينسينس النباتية المضادة للفطور
Summary
ديفينسينس النباتية دوراً هاما في الدفاع عن النبات ضد العوامل الممرضة. للاستخدام الفعال لهذه الببتيدات المضادة للفطور كوكلاء المضادة للفطور، فهم أساليب العمل (MOA) أمر بالغ الأهمية. هنا، يتم وصف أسلوب تصوير خلية يعيش لدراسة الجوانب الحرجة لوزارة الزراعة من هذه الببتيدات.
Abstract
الصغيرة الغنية سيستين ديفينسينس واحدة من أكبر مجموعات من المضيف الدفاع الببتيدات موجودة في جميع النباتات. العديد من النباتات defensins المعرض قويا في المختبر نشاط مضاد ضد واسعة الطيف من مسببات الأمراض الفطرية وبالتالي القدرة على استخدامها كعامل مضاد للفطريات في المحاصيل المعدلة وراثيا. من أجل تسخير الإمكانات الكاملة لمصنع ديفينسينس لمراقبة الأمراض، من الأهمية بمكان توضيح آلياتها للعمل (وزارة الزراعة). مع ظهور تقنيات متقدمة في الفحص المجهري، أصبح التصوير خلية يعيش أداة قوية لفهم ديناميات MOA مضاد فطري من نبات ديفينسينس. هنا، يرد وصف أسلوب تصوير خلية يعيش [كنفوكل] مجهرية على أساس استخدام اثنين defensins النبات المسمى فلوريسسينتلي (MtDef4 و MtDef5) في تركيبة مع الأصباغ الفلورية الحيوية. ويتيح هذا الأسلوب التصور في الوقت الحقيقي وتحليل الأحداث الحيوية لاستيعاب MtDef4 و MtDef5 في الخلايا الفطرية. الأهم من ذلك، ينشئ هذا التحليل على ثروة من المعلومات بما في ذلك استيعاب حركية، طريقة الدخول والتعريب سوبسيلولار من هذه الببتيدات. جنبا إلى جنب مع غيرها من أدوات الخلية البيولوجية، وفرت هذه الأساليب الحاسمة ثاقبة بديناميات وتعقد وزارة الزراعة من هذه الببتيدات. يمكن أيضا استخدام هذه الأدوات لمقارنة وزارة الزراعة من هذه الببتيدات ضد الفطريات المختلفة.
Introduction
وتطورت محطات نظام المناعة فطرية متطورة للدفاع ضد مسببات الأمراض الميكروبية النباتية1. وهم يعربون عن ترميز الجينات المضيف الدفاع الببتيدات العديدة مع نشاط مضادات الميكروبات المفترضة2. والواقع أن العديد من هذه الببتيدات عرض نشاط مضادات الميكروبات في المختبر3. ديفينسينس يضم واحدة من أكبر مجموعات من الببتيدات الدفاع المضيف في المملكة النباتية4. هذه الببتيدات الغنية سيستين، الموجبة يحمل النشاط المثبطة نمو قوية ضد الفطريات ومسببات الأمراض أووميسيتي في تركيزات micromolar وتمثل واحدة من أول خطوط الدفاع ضد هذه العوامل الممرضة5،6. بسبب نشاطها المضادة للفطور قوية، يمكن استغلال defensins في تطبيقات أجريبيوتيتشنولوجيكال لتوليد المحاصيل المقاومة للمرض. لقد ثبت overexpression المكونة من عدة مصنع ديفينسينس لتعزيز مقاومة المرض في اختبارات الدفيئة والحقل من المحاصيل المعدلة وراثيا6. من المهم كشف آليات العمل (MOA) من هذه الببتيدات المضادة للفطور من أجل تسخير كامل إمكاناتهم كأدوات فعالة لحماية المحاصيل. ومع ذلك، هي غير مفهومة وزارة الزراعة من هذه ديفينسينس النباتية. الأدلة الحالية تشير إلى أنها تظهر مختلفة وزارة الزراعة5،6،،من78. بعض ديفينسينس التصرف اكستراسيلولارلي على الفطريات واستهداف sphingolipids المقيم غشاء البلازما/جدار الخلية المحددة والإخلال بسلامة الغشاء وتنشيط السمية الخلوية مسارات9،،من1011. ، ومع ذلك، ديفينسينس المضادة للفطور التي ترانسلوكاتي داخل الخلايا الفطرية في الآونة الأخيرة اكتشفت12،،من1314. بعض من هذه ديفينسينس ربط المقيم في غشاء فوسفوليبيدات النشطة بيولوجيا وتشكيل مجمعات oligomeric بيرميبيليزي الأغشية البلازمية15،،من1617. وهكذا، وقد تم توضيح بعض الجوانب لوزارة الزراعة من نبات ديفينسينس. إلا أن وزارة الزراعة من نبات defensins المحتمل تنطوي على مجموعة معقدة من الأحداث التي لم يتم تحديدها وإدماجها في نموذج شامل. على وجه الخصوص، لا تزال هناك فجوة كبيرة في فهمنا للأهداف الخلوية من هذه الببتيدات.
مع التطورات الحديثة في تقنيات الفحص المجهري ووضع المسابر نيون الجديدة، تقنيات التصوير خلية يعيش الآن كثيرا ما تستخدم لدراسة وزارة الزراعة الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير). تكمل هذه التقنيات الأساليب المستخدمة على نطاق واسع مثل إيمونولوكاليزيشن والمجهر الإلكتروني ومجهر القوة الذرية أو التصوير المقطعي بالأشعة السينية18، التي استخدمت أساسا لتحليل آثار الببتيدات المضادة للفطور في مورفولوجية و نمو الخلايا الفطرية بما في ذلك دراسة سلامة جدار الخلية، تغييرات في أنماط النمو/المنطق التفريعي الخلية، فضلا عن بيرميبيليزيشن غشاء البلازما وقتل. ومع ذلك، كانت هذه الدراسات محدودة للتصوير الخلايا عند نقطة معينة من الزمن بعد العلاج مع الببتيدات بدلاً من أداء الوقت الفاصل بين التصوير في نفس الخلايا لرصد هذه التغيرات الدينامية في الاستجابة للتحدي ديفينسين. في السنوات الأخيرة، وقد مكن استخدام الببتيدات فلوريسسينتلي المسمى بالاقتران مع الخلايا الحية التصوير باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] التصور في الوقت الحقيقي لديناميات التفاعل أمبير – ميكروب. كلاهما بطبيعة الحال تنقيته ويمكن الموسومة مركباً كيميائيا الببتيدات المضادة للفطور مع تسميات الفلورسنت (مثلاً، ديلايت، والرودامين، بوديبي، أو فلور أليكسا أساس الأصباغ) والملاحظة المباشرة أثناء تفاعلها مع الخلايا بمرور الزمن خلية يعيش التصوير. استخدام هذه المسمى الببتيدات زاد إلى حد كبير فهمنا لمختلف جوانب بها وزارة الزراعة بما في ذلك وضع الإدخال، والترجمة سوبسيلولار، الاتجار داخل الخلايا، ومواقع عمل مضاد فطري داخل الخلايا الحية الفطرية 18.
في الآونة الأخيرة، أظهرت العديد من الدراسات أن يتم استيعاب الببتيدات المضادة للفطور المختلفة بما في ذلك مصنع defensins تعيش الخلايا الفطرية12،14،،من1920. وزارة الزراعة من هذه ديفينسينس قد تنطوي على التفاعل مع أهداف داخل الخلايا. ونحن قد أبلغت مؤخرا بعمل مصنع ديفينسين MtDef4 في اثنين من الفطريات أسكوميسيتي، نيوروسبورا crassa و جرامينيروم مغزلاويهالمضادة للفطور. وأبدى MtDef4 باستخدام مسارات مختلفة لدخول الخلية الفطرية والتعريب سوبسيلولار في هذه الفطريات14. هذه الدراسة تستخدم كيميائيا توليفها رباعي ميثيل والرودامين (طمره)-المسمى MtDef4 في تركيبة مع الأصباغ الفلورية الحيوية (صبغ الغشاء الانتقائي، FM4-64؛ صبغ الغشاء بيرمينت، “الأخضر سيتو” خلية موت مراسل الصبغة، يوديد propidium) و مثبطات الأيض. هذه التحاليل أثبتت الحركية استيعاب MtDef4 وآلياتها للنقل داخل الخلايا ولها أهداف سوبسيلولار14.
ويرد هنا، بروتوكولا للتصوير خلية يعيش باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. ويستخدم البروتوكول المسمى فلوريسسينتلي الببتيدات في تركيبة مع الأصباغ الفلورية الحيوية لدراسة التفاعلات ديفينسين الفطرية النباتية، لا سيما والممرات من إزفاء والأهداف داخل الخلايا من ديفينسينس في الخلايا الفطرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، وصف لدراسة الحركية استيعاب هذه الببتيدات داخل الخلايا الفطرية وتحديد أهدافها سوبسيلولار بخلية يعيش موثوقة منهجية تصوير باستخدام المسمى فلوريسسينتلي ديفينسينس المضادة للفطور. هذا الأسلوب أداة قوية لتصور ديناميات التفاعل بين ديفينسينس والخلايا الفطرية زمنياً ومكانيا.
…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الدكتور ر. هوارد بيرغ، مدير مرفق مجهرية المتكاملة في مركز علوم النبات دانفورث دونالد، لقيادته ويساعد مع [كنفوكل] مجهرية. الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
Referenzen
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?. Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochemie. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium. laboratory manual. , (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
