Live Cell Imaging von Pilzzellen Modi des Eintrags und subzelluläre Lokalisation der antimykotische Pflanze Defensine zu untersuchen
Summary
Pflanzlichen Defensine spielen eine wichtige Rolle in der Verteidigung der Pflanze gegen Krankheitserreger. Für effektive Nutzung dieser antimykotische Peptide als Antimykotika, verstehen ihre Wirkungsweisen (MOA) entscheidend ist. Hier ist eine live-Cell-imaging-Methode beschrieben, um kritische Aspekte der MOA dieser Peptide zu studieren.
Abstract
Kleinen Cystein-reiche Defensine sind eine der größten Gruppen von Host Verteidigung Peptiden in allen Pflanzen vorhanden. Viele pflanzlichen Defensine potente in Vitro antimykotische Aktivität gegen ein Breitspektrum Pilzerreger auszustellen und haben daher das Potenzial, als Antimykotika in transgenen Pflanzen verwendet werden. Um das volle Potenzial der Pflanze Defensine für Krankheiten Kontrolle zu erschließen, ist es wichtig, ihre Wirkmechanismen (MOA) aufzuklären. Mit dem Aufkommen der modernen Mikroskopiertechniken ist live Cell Imaging ein leistungsfähiges Werkzeug für das Verständnis der Dynamik von Antimykotika MOA von pflanzlichen Defensine geworden. Hier wird ein konfokalen Mikroskopie basierend live-Cell imaging Verfahren beschrieben mit zwei Eindringmittel bezeichnete Pflanze Defensine (MtDef4 und MtDef5) in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Visualisierung und Analyse der dynamischen Ereignisse der MtDef4 und MtDef5 Internalisierung in Pilzzellen. Wichtig ist, erzeugt dieser Assay eine Fülle von Informationen, einschließlich der Internalisierung Kinetik, Modus für die Einreise und subzelluläre Lokalisation dieser Peptide. Zusammen mit anderen biologischen Zelle-Tools haben diese Methoden kritische Einblicke in die Dynamik und Komplexität der MOA dieser Peptide zur Verfügung gestellt. Diese Tools können auch verwendet werden, die MOA dieser Peptide gegen verschiedene Pilze zu vergleichen.
Introduction
Pflanzen haben eine anspruchsvolle angeborene Immunsystem zur Abwehr der mikrobiellen Werk Krankheitserreger1entwickelt. Sie äußern zahlreiche Gen kodiert Host Verteidigung Peptide mit vermeintlichen antimikrobielle Aktivität2. In der Tat, viele dieser Peptide antimikrobielle Aktivität in Vitro3anzeigen Defensine bilden eine der größten Gruppen von Host Verteidigung Peptiden in der Pflanze Königreich4. Diese reich an Cystein, kationischen Peptide zeigen starkes Wachstum hemmende Aktivität gegen Pilz- und Eipilz Krankheitserreger in mikromolaren Konzentrationen und repräsentieren eine der ersten Linien der Verteidigung gegen diese Erreger5,6. Wegen ihrer starken antimykotische Aktivität kann Defensine ausgenutzt werden, in Agribiotechnological Anwendungen um Krankheiten resistente Pflanzen zu erzeugen. Konstitutive Überexpression von mehreren pflanzlichen Defensine hat sich gezeigt, Resistenz gegen Krankheiten in Gewächshaus und Freiland-Tests von transgenen Pflanzen6zu verbessern. Es ist wichtig, die Mechanismen der Wirkung (MOA) dieser antimykotische Peptide zu entwirren, um ihr Potenzial voll und ganz als wirksame Instrumente für den Pflanzenschutz zu erschließen. Die MOA diese Pflanze Defensine sind jedoch kaum erforscht. Aktuelle Hinweise darauf, dass sie verschiedene MOA5,6,7,8aufweisen. Einige Defensine wirken extrazellulär auf Pilze und gezielt bestimmte Zellwand/Plasma Membran resident Sphingolipide, Membran Integrität stören und aktivieren zelluläre Toxizität Wege9,10,11. Jedoch vor kurzem, wurden antimykotische Defensine, die in Pilzzellen translozieren entdeckten12,13,14. Einige von diesen Defensine binden an Membran-Resident bioaktive Phospholipide, bilden Oligomere komplexe und Plasmamembranen15,16,17permeabilize. So haben einige Aspekte des MOA von pflanzlichen Defensine aufgeklärt. Allerdings beinhalten die MOA von pflanzlichen Defensine wahrscheinlich eine komplexe Reihe von Ereignissen, die noch nicht identifiziert und in ein umfassendes Modell integriert wurden. Insbesondere bleibt eine große Lücke in unserem Verständnis der zellulären Ziele dieser Peptide.
Mit jüngsten Fortschritte in der Mikroskopie-Technologien und die Entwicklung von neuen fluoreszierende Sonden sind Leben-Zelle bildgebende Verfahren jetzt häufig verwendet, um die MOA antimikrobielle Peptide (AMPs) zu studieren. Diese Techniken ergänzen verbreitete Methoden wie Immunolocalization, Elektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie oder Röntgen-Tomographie18, die angewandt wurden, vor allem auf die Auswirkungen von Antimykotika Peptiden auf die Morphologie zu analysieren und Wachstum von Pilzzellen einschließlich der Untersuchung der Zellwand Integrität, Veränderungen in der Zelle Wachstum/Verzweigung Muster sowie Permeabilisierung der Plasmamembran und töten. Allerdings wurden diese Studien beschränkt Imaging Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Behandlung mit der Peptide anstatt Zeitraffer-Aufnahme die gleichen Zellen, ihre dynamischen Veränderungen in Reaktion auf defensin Herausforderung zu überwachen. In den letzten Jahren hat die Verwendung von Eindringmittel beschriftete Peptide in Verbindung mit live Cell imaging mit der konfokalen Mikroskopie Echtzeit-Visualisierung der Dynamik des AMP-Mikroben-Interaktionen ermöglicht. Beide natürlich gereinigt und chemisch synthetisierten antimykotische Peptide können mit Fluoreszenzmarkierungen markiert werden (z.B., DyLight, Rhodamin, BODIPY oder Alexa Fluor basierend Farbstoffe) und direkt während ihrer Interaktion mit Zellen von Time-Lapse beobachtet Live Cell Imaging. Die Verwendung dieser Peptide beschriftet unser Verständnis für die verschiedenen Aspekte der ihre MOA einschließlich Modus Eintritt, subzelluläre Lokalisation, intrazellulären Menschenhandel und Websites antimykotische Maßnahmen im lebenden Pilzzellen deutlich gestiegen 18.
Vor kurzem, haben mehrere Studien gezeigt, dass verschiedene Antimykotika Peptide einschließlich Anlage Defensine Leben Pilzzellen12,14,19,20internalisiert werden. Die MOA diese Defensine wahrscheinlich beinhalten Interaktion mit intrazellulären Ziele. Wir haben vor kurzem die antimykotische Wirkung von einer Pflanze defensin MtDef4 in zwei Schlauchpilz Pilzen, Neurospora Crassa und Fusarium Graminearumberichtet. MtDef4 wurde gezeigt, um verschiedene Wege für die Pilzzelle ein- und subzelluläre Lokalisation in diesen Pilzen14zu verwenden. Diese Studie verwendet chemisch synthetisiert Tetramethyl Rhodamin (TAMRA)-mit der Bezeichnung MtDef4 in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen (Membran-permeationsfähigen Farbstoff, SYTOX Green, der Membran selektiv Farbstoff, FM4-64; der Zelle Tod Reporter Farbstoff, Propidium Jodid) und metabolische Inhibitoren. Diese Analysen zeigten die Kinetik der Internalisierung von MtDef4, die Mechanismen der intrazellulären Transport und seine subzelluläre Ziele14.
Hier ist ein Protokoll für live Cell Imaging mit der konfokalen Mikroskopie vorgestellt. Das Protokoll nutzt Eindringmittel beschriftete Peptide in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen Pflanze defensin-Pilz-Interaktionen, insbesondere zu studieren, die Pfade der Translokation und die intrazellulären Ziele der Defensine in Pilzzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurde eine zuverlässige live-Cell Image Methodik mit dem Einsatz von Eindringmittel beschrifteten antimykotische Defensine beschrieben, die Kinetik der Internalisierung dieser Peptide in Pilzzellen zu studieren und ihre subzelluläre Ziele zu bestimmen. Diese Methode ist ein mächtiges Werkzeug, um die Dynamik der Interaktion zwischen Defensine und Pilzzellen zeitlich und räumlich zu visualisieren.
Verschiedene Methoden wurden zur Untersuchung der Verinnerlichung und intraze…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Dr. R. Howard Berg, Leiter der integrierten Mikroskopie-Einrichtung bei Donald Danforth Plant Science Center, für seine Beratung und Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
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