Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta
Summary
Defensine pianta gioca un ruolo importante nella difesa delle piante contro gli agenti patogeni. Per un uso efficace di questi peptidi antimicotici come agenti antifungini, comprendere le loro modalità di azione (MOA) è critico. Qui, è descritto un metodo di imaging di cellule vive per studiare aspetti critici di MOA di questi peptidi.
Abstract
Piccoli ricche di cisteina defensine sono uno dei più grandi gruppi di peptidi di difesa ospite presente in tutte le piante. Molti pianta defensine esibiscono potente in vitro attività antifungina contro un ampio spettro di patogeni fungini e pertanto hanno il potenziale per essere utilizzati come agenti antifungini in coltivazioni transgeniche. Al fine di sfruttare appieno il potenziale delle defensine impianto per controllo di malattie, è fondamentale per chiarire i loro meccanismi di azione (MOA). Con l’avvento delle tecniche di microscopia avanzata, formazione immagine della vivere-cella è diventato un potente strumento per comprendere le dinamiche di MOA antifungina della pianta defensine. Qui, un metodo di imaging microscopia confocale basato su cellule vive è descritti tramite due pianta fluorescente contrassegnati defensine (MtDef4 e MtDef5) in combinazione con le tinture fluorescenti vitale. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale e analisi degli eventi dinamici dell’internalizzazione di MtDef4 e MtDef5 nelle cellule fungine. D’importanza, questo test genera una ricchezza di informazioni, compresa interiorizzazione cinetica, modalità di entrata e localizzazione subcellulare di questi peptidi. Insieme ad altri strumenti biologici delle cellule, questi metodi hanno fornito approfondimenti critici la dinamica e la complessità di MOA di questi peptidi. Questi strumenti è utilizzabile anche per confrontare il MOA di questi peptidi contro funghi differenti.
Introduction
Le piante hanno sviluppato un sofisticato sistema immunitario innato per difesa contro agenti patogeni microbici pianta1. Essi esprimono numerosi peptidi di difesa ospite codificato dal gene con attività antimicrobica presunta2. Infatti, molti di questi peptidi visualizzare attività antimicrobica in vitro3. Defensine costituiscono uno dei più grandi gruppi di peptidi di difesa ospite in pianta Unito4. Questi peptidi ricchi di cisteina, cationici presentano attività inibitoria della crescita potente contro fungine e Oomycota patogeni alle concentrazioni micromolar e rappresentano una delle prime linee di difesa contro questi agenti patogeni5,6. A causa della loro potente attività antifungina, defensine possono essere sfruttate in agribiotechnological applicazioni per generare colture resistenti alle malattie. La sovraespressione costitutiva delle diverse piante defensine è stata indicata per migliorare la resistenza alle malattie nei test serra e campo di colture transgeniche6. È importante definire i meccanismi di azione (MOA) di questi peptidi antimicotici al fine di sfruttare pienamente il loro potenziale come strumenti efficaci per la protezione delle colture. Tuttavia, il MOA delle defensine vegetali è capito male. La prova corrente suggerisce che essi presentano diversi MOA5,6,7,8. Alcuni defensine agiscono extracellularly sui funghi e destinazione particolare parete cellulare/plasma membrana residente sfingolipidi, compromettere l’integrità della membrana e attivare tossicità cellulare vie9,10,11. Recentemente, tuttavia, defensine antifungine che traslocano nelle cellule fungine sono stati scoperti12,13,14. Alcuni di questi defensine associare a membrana-residente bioattivi fosfolipidi, formano complessi oligomerici e permeabilize membrane plasmatiche15,16,17. Così, alcuni aspetti di MOA delle defensine pianta sono stati delucidati. Tuttavia, il MOA delle defensine pianta probabilmente coinvolge una serie complessa di eventi che non ancora sono stati identificati e integrati in un modello globale. In particolare, ci rimane una grave lacuna nella nostra comprensione dei bersagli cellulari di questi peptidi.
Con gli avanzamenti recenti nella microscopia tecnologie e lo sviluppo di nuove sonde fluorescenti, tecniche di imaging di cellule vive ora sono frequentemente utilizzati per studiare il MOA di peptidi antimicrobici (amp). Queste tecniche completano metodi ampiamente usati come immunolocalizzazione, microscopia elettronica, microscopia a forza atomica o di tomografia a raggi x18, che sono stati impiegati principalmente per analizzare gli effetti dei peptidi antimicotici sulla morfologia e crescita delle cellule fungine, compreso lo studio dell’integrità della parete cellulare, alterazioni nel pattern di crescita/ramificazione di celle, come pure la permeabilizzazione della membrana del plasma e uccidendo. Tuttavia, questi studi sono stati limitati a imaging cellule ad un certo punto di tempo dopo il trattamento con i peptidi anziché eseguire time-lapse imaging sulle stesse cellule per monitorare i cambiamenti dinamici in risposta alla sfida di defensine. Negli ultimi anni, uso di peptidi fluorescente contrassegnati in collaborazione con live cell imaging mediante microscopia confocale ha permesso la visualizzazione in tempo reale della dinamica delle interazioni AMP – microbo. Entrambi naturalmente purificata e peptidi antimicotici chimicamente sintetizzati possono essere contrassegnate con etichette fluorescenti (ad es., DyLight, rodamina, BODIPY o Alexa Fluor basato coloranti) e osservato direttamente durante la loro interazione con le cellule da Time-lapse formazione immagine di cellule vive. L’uso di questi peptidi con l’etichetta ha aumentato significativamente la nostra comprensione dei diversi aspetti del loro MOA inclusa la modalità di ingresso, localizzazione subcellulare, traffico intracellulare e siti d’azione antifungina nelle cellule fungine viventi 18.
Recentemente, parecchi studi hanno indicato che vari peptidi antimicotici compreso impianto defensine sono interiorizzati da vivere le cellule fungine12,14,19,20. Il MOA di questi defensine probabile che comportano interazioni con obiettivi intracellulari. Recentemente abbiamo segnalato l’azione antifungina di un impianto di defensine MtDef4 in due funghi ascomiceti, Neurospora crassa e Fusarium graminearum. MtDef4 è stato indicato per utilizzare diverse vie per l’entrata delle cellule fungine e localizzazione subcellulare in questi funghi14. Questo studio usato chimicamente sintetizzato tetrametil rodamina (TAMRA)-con l’etichetta MtDef4 in combinazione con le tinture fluorescenti vitale (la tintura di membrana selettiva, FM4-64; tintura membrana-permeante, verde SYTOX; il colorante reporter di morte delle cellule, ioduro di propidio) e inibitori metabolici. Queste analisi hanno dimostrato la cinetica di interiorizzazione dei MtDef4, i suoi meccanismi di trasporto intracellulare e suoi obiettivi sottocellulari14.
Qui, un protocollo per l’imaging di cellule vive usando la microscopia confocale è presentato. Il protocollo utilizza fluorescente identificati peptidi in combinazione con coloranti vitali fluorescenti per studiare le interazioni defensina-fungine di pianta, in particolare, i percorsi di spostamento e i bersagli intracellulari di defensine in cellule fungine.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, una metodologia di imaging affidabile cellule vive con l’uso delle defensine antifungine fluorescente identificate è stato descritta per studiare la cinetica di interiorizzazione di questi peptidi in cellule fungine e per determinare i loro obiettivi sottocellulari. Questo metodo è un potente strumento per visualizzare le dinamiche dell’interazione tra cellule fungine e defensine temporalmente e spazialmente.
Vari metodi sono stati usati per studiare l’internalizzazione e l…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringraziano il Dr. R. Howard Berg, direttore del centro di microscopia integrato presso il Donald Danforth Plant Science Center, per la sua guida e aiutare con la microscopia confocale. Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
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