Завод дефензинов играть важную роль в защите растений против патогенов. Для эффективного использования этих противогрибковые пептидов как противогрибковых агентов, понимая их режимы действий (MOA) имеет решающее значение. Здесь жить клеточной изображений метод описан для изучения важнейших аспектов MOA этих пептидов.
Малые хвоща богатые дефензинов являются одним из крупнейших групп узла обороны пептидов в всех растений. Многие растения дефензинов экспонат мощным в vitro противогрибковые активностью в отношении широкого спектра возбудителей грибковых и поэтому имеют потенциал для использования в качестве противогрибковых агентов в трансгенных культур. Для того, чтобы задействовать весь потенциал растений дефензинов для контроля заболеваний, важно разъяснить их механизмов действий (MOA). С появлением микроскопии передовых методов клеток стала мощным инструментом для понимания динамики противогрибковые MOA дефензинов растений. Здесь конфокальная микроскопия на основе клеток изображений метод описан с помощью двух дефензинов дневно обозначенные завода (MtDef4 и MtDef5) в сочетании с жизненно флуоресцентными красителями. Этот метод позволяет в реальном времени визуализации и анализа динамических событий MtDef4 и MtDef5 интернализации в грибные клетки. Важно отметить, что этот assay генерирует большой объем информации, включая интернализации кинетики, режим въезда и внутриклеточных локализации этих пептидов. Наряду с другими инструментами биологических клеток эти методы предоставили критической понимание динамики и сложности MOA этих пептидов. Эти инструменты могут также использоваться для сравнения MOA эти пептиды против разных грибов.
Растения эволюционировали сложной иммунной системы для защиты от патогенных микробов завод1. Они выражают многочисленные ген закодированы принимающей обороны пептиды с предполагаемым Антимикробная активность2. Действительно многие из этих пептидов отображения антимикробную активность в пробирке3. Дефензинов составляют одну из крупнейших групп узла обороны пептидов в Царство растений4. Эти богатые цистеином, катионных пептидов демонстрируют мощный рост ингибиторная активность против грибковых и оомицеты патогенов в микромолярных концентрациях и представляют собой одну из первой линии обороны против этих патогенов5,6. Из-за их мощных противогрибковых деятельность может быть использована дефензинов в agribiotechnological приложениях для создания болезням сельскохозяйственных культур. Было показано, что учредительный гиперэкспрессия нескольких растений дефензинов повышения сопротивляемости болезням в оранжерею и поле испытания трансгенных культур6. Важно раскрыть механизмы действия (MOA) эти противогрибковые пептиды для того, чтобы полностью использовать их потенциал как эффективных инструментов для защиты урожая. Однако плохо понимаются MOA дефензинов этих растений. Текущие данные свидетельствуют о том, что они демонстрируют разные MOA5,6,,78. Некоторые дефензинов действовать внеклеточно на грибки и целевых конкретных клеточной стенки/плазмы мембраны-резидентов Сфинголипиды, нарушить целостность мембраны и активировать сотовой токсичности пути9,10,11. Недавно однако, противогрибковые дефензинов, которые перемещают в грибные клетки были обнаружили12,,1314. Некоторые из этих дефензинов связываются с биоактивными фосфолипиды мембраны резидентов, образуют олигомерных комплексов и разрушения мембраны плазмы15,16,17. Таким образом были освещены некоторые аспекты MOA дефензинов растений. Однако MOA растений дефензинов вероятно включают сложный набор событий, которые еще не были определены и включены в комплексной модели. В частности сохраняется серьезный пробел в нашем понимании клеточных мишеней этих пептидов.
С последних достижений в микроскопии технологий и разработки новых флуоресцентных зондов методы визуализации клеток в настоящее время часто используются для изучения MOA антимикробных пептидов (AMPs). Эти методы дополняют широко используемые методы, такие как immunolocalization, электронная микроскопия, атомно-силовой микроскопии или рентгеновской томографии18, которые использовались главным образом для того, чтобы проанализировать влияние противогрибковые пептидов на морфологию и рост грибковых клеток, включая изучение целостности клеточной стенки, изменения шаблонов роста/ветвления клеток, а также плазматической мембраны permeabilization и убийство. Тем не менее эти исследования были ограничены для визуализации ячеек в определенный момент времени после лечения с пептидами вместо выполнения покадровой изображений на те же клетки для мониторинга их динамические изменения в ответ на дефенсина вызов. В последние годы использование дневно обозначенные пептидов в сочетании с живой клетки изображений с помощью конфокальной микроскопии позволило в реальном времени визуализации динамики AMP-микробных взаимодействий. Как естественно очищенной и химически синтезированных противогрибковые пептиды могут быть помечены с флуоресцентные метки (например, DyLight, родамин, BODIPY или Alexa Fluor на основе красителей) и непосредственно под наблюдением во время их взаимодействия с клетками промежуток времени жить Клеточная томография. Использование этих помечены пептиды значительно возросло понимание различных аспектов их MOA, включая режим въезда, субцеллюлярные локализации, внутриклеточных торговлю и сайты противогрибковые действий в течение жизни грибковых клеток 18.
Недавно несколько исследований показали, что различные противогрибковые пептиды, включая завод дефензинов относить на счет жизни грибковых клеток12,14,19,20. MOA этих дефензинов вероятно предусматривают взаимодействие с внутриклеточной целей. Недавно мы сообщили противогрибковое действие дефенсина MtDef4 в двух грибов аскомицетов, Нейроспора густая и Fusarium graminearumзавода. MtDef4 было показано использование различных путей для грибковых клеток вход и внутриклеточных локализации в этих грибов14. Это исследование используется химически синтезированных родамин тетраметилсвинца (ТАМРА)-помечены MtDef4 в сочетании с жизненно Краски люминесцентные, флуоресцентные (мембраны селективного окрашивания, FM4-64; мембраны permeant краситель, SYTOX зеленая краска репортер для смерти клетки, пропидий йодидом) и метаболические ингибиторы. Эти анализы показали кинетика интернализации MtDef4, ее механизмы формирования внутриклеточного транспорта и его субцеллюлярные цели14.
Здесь представлен протокол для клеток изображений с помощью конфокальной микроскопии. Протокол использует дневно обозначенные пептидов в сочетании с жизненно флуоресцентных красителей для изучения растений дефенсина грибковые взаимодействия, в частности, пути транслокации и внутриклеточных целей дефензинов в грибковых клеток.
В этом исследовании надежный клеток изображений методологии с использованием дневно обозначенные противогрибковые дефензинов был описан для изучения кинетики интернализации этих пептидов в грибные клетки и определить их субцеллюлярные целей. Этот метод является мощным инструменто…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-р р. Говард Берг, директор механизма комплексной микроскопии в Дональд Данфорт завод научный центр, за его руководство и помочь с confocal микроскопии. Авторы имеют никакого конфликта интересов объявить.
FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
SP8-X confocal microscope | Leica | ||
ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
Imaris software | Bitplane | For Image analysis |