Жить клеточной изображений грибковых клеток расследовать режимы записи и внутриклеточных локализации дефензинов противогрибковые завод
Summary
Завод дефензинов играть важную роль в защите растений против патогенов. Для эффективного использования этих противогрибковые пептидов как противогрибковых агентов, понимая их режимы действий (MOA) имеет решающее значение. Здесь жить клеточной изображений метод описан для изучения важнейших аспектов MOA этих пептидов.
Abstract
Малые хвоща богатые дефензинов являются одним из крупнейших групп узла обороны пептидов в всех растений. Многие растения дефензинов экспонат мощным в vitro противогрибковые активностью в отношении широкого спектра возбудителей грибковых и поэтому имеют потенциал для использования в качестве противогрибковых агентов в трансгенных культур. Для того, чтобы задействовать весь потенциал растений дефензинов для контроля заболеваний, важно разъяснить их механизмов действий (MOA). С появлением микроскопии передовых методов клеток стала мощным инструментом для понимания динамики противогрибковые MOA дефензинов растений. Здесь конфокальная микроскопия на основе клеток изображений метод описан с помощью двух дефензинов дневно обозначенные завода (MtDef4 и MtDef5) в сочетании с жизненно флуоресцентными красителями. Этот метод позволяет в реальном времени визуализации и анализа динамических событий MtDef4 и MtDef5 интернализации в грибные клетки. Важно отметить, что этот assay генерирует большой объем информации, включая интернализации кинетики, режим въезда и внутриклеточных локализации этих пептидов. Наряду с другими инструментами биологических клеток эти методы предоставили критической понимание динамики и сложности MOA этих пептидов. Эти инструменты могут также использоваться для сравнения MOA эти пептиды против разных грибов.
Introduction
Растения эволюционировали сложной иммунной системы для защиты от патогенных микробов завод1. Они выражают многочисленные ген закодированы принимающей обороны пептиды с предполагаемым Антимикробная активность2. Действительно многие из этих пептидов отображения антимикробную активность в пробирке3. Дефензинов составляют одну из крупнейших групп узла обороны пептидов в Царство растений4. Эти богатые цистеином, катионных пептидов демонстрируют мощный рост ингибиторная активность против грибковых и оомицеты патогенов в микромолярных концентрациях и представляют собой одну из первой линии обороны против этих патогенов5,6. Из-за их мощных противогрибковых деятельность может быть использована дефензинов в agribiotechnological приложениях для создания болезням сельскохозяйственных культур. Было показано, что учредительный гиперэкспрессия нескольких растений дефензинов повышения сопротивляемости болезням в оранжерею и поле испытания трансгенных культур6. Важно раскрыть механизмы действия (MOA) эти противогрибковые пептиды для того, чтобы полностью использовать их потенциал как эффективных инструментов для защиты урожая. Однако плохо понимаются MOA дефензинов этих растений. Текущие данные свидетельствуют о том, что они демонстрируют разные MOA5,6,,78. Некоторые дефензинов действовать внеклеточно на грибки и целевых конкретных клеточной стенки/плазмы мембраны-резидентов Сфинголипиды, нарушить целостность мембраны и активировать сотовой токсичности пути9,10,11. Недавно однако, противогрибковые дефензинов, которые перемещают в грибные клетки были обнаружили12,,1314. Некоторые из этих дефензинов связываются с биоактивными фосфолипиды мембраны резидентов, образуют олигомерных комплексов и разрушения мембраны плазмы15,16,17. Таким образом были освещены некоторые аспекты MOA дефензинов растений. Однако MOA растений дефензинов вероятно включают сложный набор событий, которые еще не были определены и включены в комплексной модели. В частности сохраняется серьезный пробел в нашем понимании клеточных мишеней этих пептидов.
С последних достижений в микроскопии технологий и разработки новых флуоресцентных зондов методы визуализации клеток в настоящее время часто используются для изучения MOA антимикробных пептидов (AMPs). Эти методы дополняют широко используемые методы, такие как immunolocalization, электронная микроскопия, атомно-силовой микроскопии или рентгеновской томографии18, которые использовались главным образом для того, чтобы проанализировать влияние противогрибковые пептидов на морфологию и рост грибковых клеток, включая изучение целостности клеточной стенки, изменения шаблонов роста/ветвления клеток, а также плазматической мембраны permeabilization и убийство. Тем не менее эти исследования были ограничены для визуализации ячеек в определенный момент времени после лечения с пептидами вместо выполнения покадровой изображений на те же клетки для мониторинга их динамические изменения в ответ на дефенсина вызов. В последние годы использование дневно обозначенные пептидов в сочетании с живой клетки изображений с помощью конфокальной микроскопии позволило в реальном времени визуализации динамики AMP-микробных взаимодействий. Как естественно очищенной и химически синтезированных противогрибковые пептиды могут быть помечены с флуоресцентные метки (например, DyLight, родамин, BODIPY или Alexa Fluor на основе красителей) и непосредственно под наблюдением во время их взаимодействия с клетками промежуток времени жить Клеточная томография. Использование этих помечены пептиды значительно возросло понимание различных аспектов их MOA, включая режим въезда, субцеллюлярные локализации, внутриклеточных торговлю и сайты противогрибковые действий в течение жизни грибковых клеток 18.
Недавно несколько исследований показали, что различные противогрибковые пептиды, включая завод дефензинов относить на счет жизни грибковых клеток12,14,19,20. MOA этих дефензинов вероятно предусматривают взаимодействие с внутриклеточной целей. Недавно мы сообщили противогрибковое действие дефенсина MtDef4 в двух грибов аскомицетов, Нейроспора густая и Fusarium graminearumзавода. MtDef4 было показано использование различных путей для грибковых клеток вход и внутриклеточных локализации в этих грибов14. Это исследование используется химически синтезированных родамин тетраметилсвинца (ТАМРА)-помечены MtDef4 в сочетании с жизненно Краски люминесцентные, флуоресцентные (мембраны селективного окрашивания, FM4-64; мембраны permeant краситель, SYTOX зеленая краска репортер для смерти клетки, пропидий йодидом) и метаболические ингибиторы. Эти анализы показали кинетика интернализации MtDef4, ее механизмы формирования внутриклеточного транспорта и его субцеллюлярные цели14.
Здесь представлен протокол для клеток изображений с помощью конфокальной микроскопии. Протокол использует дневно обозначенные пептидов в сочетании с жизненно флуоресцентных красителей для изучения растений дефенсина грибковые взаимодействия, в частности, пути транслокации и внутриклеточных целей дефензинов в грибковых клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании надежный клеток изображений методологии с использованием дневно обозначенные противогрибковые дефензинов был описан для изучения кинетики интернализации этих пептидов в грибные клетки и определить их субцеллюлярные целей. Этот метод является мощным инструменто…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р р. Говард Берг, директор механизма комплексной микроскопии в Дональд Данфорт завод научный центр, за его руководство и помочь с confocal микроскопии. Авторы имеют никакого конфликта интересов объявить.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
Referenzen
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?. Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochemie. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium. laboratory manual. , (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
