בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק
Summary
אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) – סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.
Abstract
התפתחות המוח הוא תהליך מורכב, שבשליטת באופן מרחבי בעיות מפרק מעברי צבע של אורגניזם ותוכניות תעתיק שונה. בנוסף, שינויים epigenetic כרומטין, כמו היסטון מתילציה, יש תפקיד חשוב עבור ביסוס ושמירה על גורלם תא ספציפי בתוך התהליך הזה. הרוב המכריע של היסטון מתילציה מתרחשת על הזנב היסטון גמיש, הנגיש מכפילי היסטון, מחקים של חלבונים קורא היסטון. לעומת זאת, H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, הייתה שם בפונקציות התפתחותיים שונים. מתילציה H3K79 אבולוציונית כולו, ניתן למצוא מגוון רחב של מינים של הומו ספיינס כדי האפייה. השינוי מתרחש בקרב אוכלוסיות תאים שונים בתוך אורגניזמים, כולל אבות עצבית. המיקום של מתילציה H3K79 בתחום הכדוריים של היסטון 3 מקשה להעריך. כאן, אנו מציגים שיטות כדי לבודד, קדמון קורטיקלית התרבות תאים (CPCs) של רקמת מוח קליפתי עובריים (E11.5-E14.5) או אסטרוציטומה נוירון פרטנית אבות (CGNPs) מרקמות כמחנכת (P5-P7), וכדי ביעילות immunoprecipitate H3K79me2 עבור ה-PCR כמותי (qPCR) ורצף הגנום כולו.
Introduction
הפונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי של המוח הם מורכבים מאוד רגישים לשינויים פיזיים וסביבתיים. המוח מורכב שלושה חלקים כללי הינד-, אמצע, הקדמי, אשר מחוברים עמוקות. בתוך הקדמי, ניתן לחלק את telencephalon של telencephalon הגבי (DT), של telencephalon הגחוני (וי טי). DT של עכברים מורכב שש שכבות קורטיקלית אשר נוצרים בין E11.5 לבין E18.5 אופן “הפוכה”1. VT כולל את הרוחביים ganglionic בפיתוח, המהווים את2,של גרעיני הבסיס3מאוחר יותר. מספר סוגי תאים יכולים להיות מסווגים במערכת העצבים המרכזית יונקים כמו נוירונים, האסטרוציטים או oligodendrocytes להפוך4, אשר להתפתח באופן מרחבי בעיות מפרק5. קודם כל, עצבי ובתאים (NPCs) להצמיח סוגים שונים של נוירונים, interneurons VT ולאחר ההקרנה נוירונים ב- DT, ובהמשך תאי גליה (למשל, האסטרוציטים6). במהלך פיתוח קורטיקלית, השכבה השטחית ביותר (שכבה אני), אשר מכיל תאים Cajal Retzius, נוצר לראשונה. לאחר מכן, בין E12.5 ו E14.5, NPCs צור עצביים לשכבות העמוקות (השישי, V) בזמן בין 14.5, 16.5, אבות להצמיח השכבה העליונה (IV-II) נוירונים7,8. זהות עצביים צוין על ידי מורפוגן-induced בעיות מפרק מרחבי תעתיק תוכניות שונות, בנוסף על-ידי תוכניות epigenetic2.
המוח הקטן, אשר הוא מעורב קואורדינציה, ממוקם על hindbrain ומפתחת בין E10 בערך P20 עכברים9. הוא מכיל קליפת אסטרוציטומה ואת הגרעינים אסטרוציטומה10. קליפת אסטרוציטומה למבוגרים מורכב משלוש שכבות, שבהפסד מולקולרית, השכבה Purkinje תא, השכבה הפנימית ביותר פרטנית המכיל נוירונים פרטנית10. התאים גרגר אסטרוציטומה הנוירונים הקטן ביותר, מייצגים כ- 80% של הנוירונים בכל המוח חוליות11. להתפתח סימנים מקדימים ממוקם באזור נבטי חיצוניים והם נודדים דרך השכבה Purkinje תא היעד שלהם12. כמו ב- telencephalon, ההתפתחות של הצרבלום מוסדר על ידי אורגניזם חשוב מספר, אשר יש פונקציות ספציפיות זמן-מרחב ותלוי וליזום תוכניות תעתיק10מוגדרים.
הפיתוח של שכבות קורטיקליים ו אסטרוציטומה נשלטת על ידי ביטוי גנים ברמת השעתוק של אורגניזם מסוים ועל, לכן, ידי המדינה כרומטין של ה-DNA. בתצוגה פשוטה, כרומטין הברית יכולה להיות מחולקת euchromatin כפעיל transcriptionally הטרוכרומטין כמו אזורים שקטים transcriptionally. נוקלאוזום היחידה הבסיסית של כרומטין מכיל שני עותקים של כל היסטון הליבה H2A, ויזת עבודה H2B, H3 ו- H4, מוקף 147 בסיסי זוגות של הדנ א13. שינויים היסטוניים עוברות שינוי מאוד post-translationally על ידי מתילציה, acetylation, זרחון, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, דיאמינציה פרולין isomerization14,15. היסטון ליזין מתילציה נחשב השינוי היסטון היציב ביותר ששולטת שעתוק, שכפול, רקומבינציה16, נזק לדנ א תגובה17, ו החתמה גנומית18. Lysines יכול להיות מונו, di- או תלת-מפוגל19 , מופיעים לא רק על זנבות היסטון נגיש, אלא גם בתוך תחום הכדוריים של שינויים היסטוניים20. Methylations ספציפי ב H3K4 ו H3K36 קשורים בעיקר עם euchromatin, methylations מסוים H3K9, H3K27 או H4K20 מצויים בעיקר באזורים heterochromatic, למרות כל שאריות ממוקמים בתוך הזנב היסטון14, 19,21. מתילציה H3K79 הינו ממוקם בתוך תחום הכדוריים היסטון, שויכה פעילות גנים ברמת השעתוק, אבל גם עם אזורים גנומית אינרטי transcriptionally22. השינוי אבולוציונית כולו מאז זה נצפתה שמרים, התימוס עגל, עוף ו האנושי23. מונו H3K79 di, trimethylation (H3K79me1, me2, me3) הם מזורז על ידי24,methyltransferases DOT1L25 היסטון גרעיני להגדיר תחום המכיל חלבון 2 (Nsd2)26. DOT1L הייתה שם התפשטות, DNA לתקן ו סלולריים reprograming27. אובדן Dot1l בעכברים מוביל למוות טרום לידתי סביב28,E10.529שלב התפתחותי. במהלך התפתחות הלב, בידול myocardiocyte, DOT1L חיוני עבור ג’ין ביטוי תקנה30. במערכת העצבים המרכזית, פונקציה DOT1L עשוי להיות מעורב בשפופרת פגמים בתעלה פיתוח31, מעורב בדיכוי Tbr1-ביטוי במהלך פיתוח הקדמי32, עשוי לתפקד בוויסות של ER-מתח התגובה הגנים33. תלויי-הקשר הפעלה או המדחיק הפעולה של H3K79me, במיוחד עם ויוו מצבים כמו הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית, הוא תאריך רק חלקית הבין32. מאז H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, זה sterically פחות נגיש לעומת שינויים על זנבות היסטון גמיש23. כדי להבין את תפקוד H3K79 מתילציה, דרושות שיטות ניתוח לשחזור ואמין כדי לקבוע את מיקום שלה ואת הסביבה גנומית. שיטות העבודה אנו מציגים שיטות בידוד של אבות עצביות שונות (CPCs של קליפת המוח) ו- CGNPs עבור המוח הקטן, טיפול יעיל של מעכבי DOT1L שיטה שבב לנתח מתילציה H3K79 דרך qPCR או רצף זמן שונים נקודות במהלך הפיתוח קורטיקליים ו אסטרוציטומה. לקבלת מבט כולל על הפרוטוקול והאפשרויות שלה, ראה איור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם שתי דרכים עיקריות לביצוע כרומטין immunoprecipitation כדי לזהות את תפוסת גנומית של שינויים היסטון, גורמי שעתוק, הקוראים קוד היסטון, סופרים או מחקים. אחת היא שיטת צ’יפ מקורי בעזרת נוקלאז מתעכל, יליד כרומטין עבור immunoprecipitation, והשני הוא הציג השיטה באמצעות כרומטין מחברים-קבוע, הוטו, שבו את נוקליאוזומ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים הנרייטה Bertemes שעזרת להקים פרוטוקול טיפוח CGN בתוך המעבדה. הנייר בשיטה זו נתמכה על ידי במימון DFG CRC992 אפיגנטיקה רפואי על ידי מימון לטלוויזיה. המחברים להכיר את התמיכה של קבוצת גלקסי פרייבורג (freiburg): Pavankumar Videm, ביורן Grüning, פרופסור רולף Backofen, ביואינפורמטיקה, אוניברסיטת פרייבורג, גרמניה ממומן על ידי שיתופי מחקר מרכז 992 אפיגנטיקה רפואי (DFG גרנט SFB 992/1/2012) גרמניה הפדרלית שר החינוך ואת המחקר (BMBF גרנט 031 A538A RBC (de. אי)).
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
Referenzen
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
- Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
- Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
- Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
- McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
- Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neurowissenschaften. 162, 549-559 (2009).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
- Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
- Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
- Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
- Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
- Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
- Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
- van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
- Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
- Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
- Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
- Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).
