Изоляция и культивирование нервных прародителей, следуют иммунопреципитации Chromatin гистона 3 лизина 79 Dimethylation марки
Summary
Мы представляем эффективный и воспроизводимый метод для изоляции и культуры клетки-предшественники нейронных от эмбриональных и послеродовой мозговой ткани для chromatin иммунопреципитации (чип) гистона 3 лизина 79 dimethylation (H3K79me2) – гистона знак, расположенный в пределах шаровидные домен гистона 3.
Abstract
Развитие мозга является сложным процессом, который находится под контролем образом височно пространственные градиенты morphogens и различных транскрипционный анализ программ. Кроме того изменения эпигеномные хроматина, как метилирование гистонов, имеют важную роль для установления и поддержания судьбы конкретных ячеек в рамках этого процесса. Подавляющее большинство метилирование гистонов происходит на гибкой гистона хвост, который доступен для гистона модификаторы, ластики и читатель гистоны. В противоположность этому H3K79 метилирование расположен в шаровых области гистона 3 и вовлечены в различные области развития функций. H3K79 метилирование эволюционно сохраняется и можно найти в широком диапазоне видов от Homo sapiens в Saccharomyces cerevisiae. Изменение происходит в разных клеточных популяций в пределах организмов, включая нейронные прародителями. Расположение H3K79 метилирование в шаровых области гистона 3 делает его трудно оценить. Здесь мы представляем методы для изоляции и корковые прародитель культуры клеток (CPC) от эмбриональных корковых мозговой ткани (E11.5-E14.5) или мозжечковая гранулированных нейрон прародителями (CGNPs) от послеродового ткани (P5-P7), а также эффективно immunoprecipitate H3K79me2 для количественного PCR (ПЦР) и секвенирования генома широкий.
Introduction
Чувств, мотор и когнитивных функций мозга являются весьма сложными и подвержены физическим и экологических изменений. Мозг состоит из трех основных частей Хинд-, средне-и переднего мозга, которые глубоко связаны. В рамках переднего конечного мозга можно разделить на спинной конечного мозга (DT) и брюшной конечного мозга (VT). DT мышей состоит из шести корковых слоев, которые формируются между E11.5 и E18.5 в форме «наизнанку»1. ЖТЛ включает Ганглиозный Высокопреосвященства в развитии, которые впоследствии образуют базальных ганглиев2,3. Несколько типов клеток могут быть классифицированы в млекопитающих центральной нервной системы, таких как нейроны, астроциты или4олигодендроциты, которые развиваются в височно пространственной способом5. Во-первых нейронные прогениторных клеток (НПС) порождают различные виды нейронов, интернейронов и VT, проекции нейронов в DT, а позднее на глиальных клеток (например, астроциты6). Во время разработки коры головного мозга, наиболее поверхностный слой (уровень I), который содержит клетки Кахаля-Ретциуса, формируется сначала. Затем между E12.5 и E14.5, НПС генерировать глубже нейрональных слоёв (VI, V) во время между 14,5 и 16,5, прародители порождают верхний слой (IV-II) нейронов7,8. Нейрональных личность задается путем различных morphogen индуцированной височно пространственной транскрипционный анализ программ и дополнительно эпигеномные программы2.
Мозжечка, который подразумевается в двигательной координации, расположен в задний мозг и развивается между E10 и около P20 в мышей9. Он содержит коры мозжечка и мозжечковая ядер10. Взрослый коры мозжечка состоит из трех слоев, внешний молекулярный слой, слоя клеток Пуркинье и внутренний зернистый слой, содержащий гранулированных нейронов10. Мозжечковая гранул клетки наименьшее нейронов и составляют около 80% всех нейронов мозга позвоночных11. Они развиваются из прекурсоров, расположенных в зоне внешней зародышевого и мигрируют через слой клеток Пуркинье, чтобы их назначения12. Как в конечного мозга, развитие мозжечка регулируется несколько важных morphogens, которые имеют конкретные и пространства зависящие от времени функций и инициировать определенные транскрипционный анализ программы10.
Разработка слои коры и верхней мозжечковой контролируется transcriptional выражением конкретных morphogens и, таким образом, состояние хроматина ДНК. В упрощенном режиме хроматина государства можно разделить на euchromatin как транскрипционно активная и гетерохроматин как транскрипционно немого регионов. Нуклеосома как основной ячейкой хроматина содержит две копии каждого ядра гистона H2A, H2B, H3 и H4, окруженный 147 пар оснований ДНК13. Высоко post-translationally гистонами изменяются путем метилирования, ацетилирования, фосфорилирование, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, дезаминирование и пролина изомеризации14,15. Лизин метилирование гистонов считается наиболее стабильных гистона модификация, которая контролирует транскрипции, репликации, рекомбинация16, повреждение ДНК ответ17и геномный импринтинг18. Lysines может быть моно-, ди-или tri метилированную19 и появляются не только на доступные гистона хвосты, но и внутри шаровидных домена гистонами20. Конкретные methylations H3K4 и H3K36 в основном связаны с euchromatin, конкретных methylations в H3K9, H3K27 или H4K20 главным образом найдены в гетерохроматиновых, хотя все остатки расположены в пределах гистона хвост14, 19,21. H3K79 метилирование расположен в пределах домена шаровидных гистона и был связан с транскрипционный анализ активности, но и с транскрипционно инертных регионах геномной22. Модификация эволюционно сохраняется так, как было отмечено в дрожжи, вилочковой железы теленка, курица и человека23. H3K79 моно, ди и trimethylation (H3K79me1, me2, me3) катализируемые гистона methyltransferases DOT1L24,25 и ядерных SET домен-содержащих белков 2 (Nsd2)26. DOT1L причастен к распространению, репарации ДНК и сотовых перепрограммирования27. Потеря Dot1l в мышах приводит к пренатальной смерти вокруг28,E10.5 стадии развития29. Во время разработки сердца и myocardiocyte дифференциации DOT1L имеет важное значение для ген выражение правила30. В центральной нервной системе, DOT1L функция может быть причастны развития нервной трубки31, он участвует в подавлении Tbr1-выражение во время развития переднего32и может функционировать в регулировании ER-стресс ответ генов33. Контекстно зависимые активации или подавления действий H3K79me, особенно с в естественных условиях ситуаций, как развитие центральной нервной системы, является на сегодняшний день только частично понял32. Так как H3K79 метилирование расположен в шаровых области гистона 3, он доступен труднодоступных меньше по сравнению с изменения на гибкой гистона хвосты23. Чтобы понять функцию H3K79 метилирование, необходимы методы анализа надежных и воспроизводимых для определения его местоположения и геномная окружающей среды. В этом документе методы мы представляем методы изоляции различных нейронных прародителями (CPC для коры) и CGNPs для мозжечка, эффективное лечение ингибитором DOT1L, и чип метода для анализа метилирования H3K79 через ПЦР или последовательности в разное время очков во время разработки корковых и мозжечка. Обзор протокола и его возможности смотрите Рисунок 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует два основных способа для выполнения иммунопреципитации chromatin для выявления геномной размещение изменения гистона, факторов транскрипции, гистонов код читателей, писателей или ластиков. Один метод чип с помощью нуклеиназы переваривается, родной chromatin для иммунопреципитаци?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Генриетта Bertemes за помощь в создании протокола CGN культивирования в лаборатории. Эпигенетики финансируемых DFG медицинской CRC992 этот метод бумага была поддержана финансирование для ТВ. Авторы признают поддержку команды Галактика Фрайбург: Pavankumar Videm, Бьорн Grüning и профессор Рольф Backofen, Биоинформатика, Университет Фрайбурга, Германия финансируется совместных исследований центр 992 медицинской эпигенетики (DFG Грант SFB 2012 992/1) и немецкого федерального министерства образования и научных исследований (BMBF Грант 031 A538A РБК (de. NBI)).
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
Referenzen
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
- Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
- Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
- Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
- McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
- Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neurowissenschaften. 162, 549-559 (2009).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
- Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
- Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
- Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
- Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
- Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
- Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
- van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
- Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
- Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
- Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
- Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).
