절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배
Summary
우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.
Abstract
두뇌 개발 transcriptional 프로그램과 다른 morphogens의 기울기로 영역 공간 방식으로 제어 되는 복잡 한 과정 이다. 또한, 히스톤 메 틸 화 처럼 epigenetic chromatin 수정 설치 하 고이 프로세스에서 특정 세포 운명을 유지에 대 한 중요 한 역할이 있다. 대부분 히스톤 메 틸 화는 히스톤 한정자, 지우개, 및 히스톤 리더 단백질 유연한 히스톤 꼬리에 발생 합니다. 대조적으로, H3K79 메 틸 화는 히스톤 3의 구형 도메인에 있으며 다른 발달 기능에 연루. H3K79 메 틸 화 봤을 보존 하 고 찾을 수 있습니다 다양 한 종에서에서 호모 사피엔스 에서 Saccharomyces cerevisiae. 수정 신경 창시자를 포함 한 유기 체 내의 다른 세포 인구에서 발생 합니다. 히스톤 3의 구형 도메인에서 H3K79 메 틸 화의 위치는 평가 하기 어려운 있습니다. 여기, 우리가 격리 하는 방법을 제시 하 고 문화 대뇌 피 질의 조상 세포 (Cpc) 배아 대뇌 피 질의 뇌 조직 (E11.5-E14.5) 또는 소 뇌과 립 상 신경 창시자 (CGNPs)에서 출생 후 조직 (P5-P7), 그리고 효율적으로 immunoprecipitate에서 정량 PCR (정량) 및 게놈 넓은 시퀀싱에 대 한 H3K79me2.
Introduction
두뇌의 감각, 모터, 및 인식 함수는 매우 복잡 하 고 물리적, 환경 변화에 취약 합니다. 깊이 연결 되는 3 개의 일반적인 부품은 뒷 다리-, 중간-및 개, 두뇌에 의하여 이루어져 있다. 개, 내는 telencephalon 등 telencephalon (DT)와 복 부 telencephalon (VT)으로 나눌 수 있습니다. 6 대뇌 피 질의 레이어 E11.5와 E18.5 사이 “내부-아웃” 방식으로1에서 형성 되는 쥐의 DT에 의하여 이루어져 있다. 버몬트 나중 형성 기초 중추2,3개발에 절 정령을 포함 합니다. 여러 종류 나눌 수 있다 신경, 이다, 또는 oligodendrocytes4같은 포유류 중추에서5영역 공간으로에서 발전 하는. 첫째, 신경 조상 세포 (Npc)에 게 상승 다른 종류의 뉴런, 버몬트, 및 프로젝션 뉴런 수 DT에서 그리고 glial 세포 (예를 들면, 이다6) 나중에. 대뇌 피 질의 개발, 가장 표면 층 (전 층), 먼저 형성 된다 Cajal Retzius 셀 포함. 다음, E12.5 및 E14.5, 사이 NPCs 더 깊은 신경 층 (VI, V) 동안 14.5, 16.5, 창시자 줄 상승 상위 레이어 (4-II) 신경7,8사이 생성합니다. 신경 정체성 다른 morphogen 유발 영역 공간 transcriptional 프로그램 및 또한 epigenetic 프로그램2에 의해 지정 됩니다.
모터 조정에 연루는, 소 뇌는 hindbrain에 있으며, 쥐9E10 사이 대략 P20 개발. 그것은 소 뇌 피 질과 소 뇌 핵10포함 되어 있습니다. 3 레이어, 가장 뒤쪽 분자 층, Purkinje 세포 층 그리고 포함 하는 세부적인 신경10안쪽 세분화 된 계층 성인 소 뇌 피 질에 의하여 이루어져 있다. 소 뇌과 립 세포 작은 신경 이며11척 추가 있는 두뇌 모든 뉴런의 약 80%를 나타냅니다. 그들은 선구자 외부 새싹 영역에서 개발 하 고 그들의 대상12Purkinje 세포 층을 통해 이동. 처럼 telencephalon에서 소 뇌의 개발은 몇 가지 중요 한 morphogens에 의해 규제 됩니다, 어떤 특정 시간 및 공간 종속 기능을가지고 시작 정의 transcriptional 프로그램10.
대뇌와 소 뇌 레이어의 개발 특정 morphogens의 transcriptional 식으로 하 고, 따라서, DNA의 염색 질 상태에 의해 제어 됩니다. 단순화 된 보기에서 chromatin 상태 transcriptionally 활성화로 euchromatin와 섬으로 transcriptionally 자동 영역으로 나눌 수 있습니다. Chromatin의 기본 단위로 nucleosome의 복사본 두 개가 각 코어 히스톤 H2A, H2B, H3, H4, 둘러싸인 147 기본적인 쌍 DNA13의 포함 되어 있습니다. 히스톤 메 틸 화, acetylation, 인 산화, ubiquitination, sumoylation, ADP ribosylation, 탈, 그리고 프롤린 isomerization14,15post-translationally 높은 수정 됩니다. 히스톤 lysine 메 틸 화 녹음 방송, 복제, 재결합16, DNA 손상 응답17및 게놈 각 인18제어 하는 가장 안정적인 히스톤 수정 될 여겨진다. Lysines 모노, 디, 또는 트라이 갠19 하 고 액세스할 수 히스톤 꼬리에 뿐만 아니라 히스톤20의 구형 도메인 내의 표시 수 있습니다. H3K4 및 H3K36에 특정 methylations euchromatin와 주로 관련 된, 모든 잔류물은 히스톤 꼬리14, 내에 있는 특정 methylations H3K9, H3K27, 또는 H4K20에 주로 heterochromatic 지구에서 발견은 19,21. H3K79 메 틸 화는 히스톤 구형 도메인 내에 있는 이며 transcriptional 활동, 뿐만 아니라 transcriptionally 불활성 게놈 지역22와 연결 되었습니다. 수정이 효 모, 송아지 흉 선, 닭, 및 인간의23에서 관찰 되었습니다 때문에 진화론 보존 됩니다. H3K79 모노, 디, 및 trimethylation (H3K79me1, me2, me3) 히스톤 methyltransferases DOT1L,2425 와26핵 설정된 도메인에 포함 된 단백질 2 (Nsd2) 의해 촉매 된다. DOT1L 확산, DNA 수리, 및27reprograming 휴대에 연루 이다. 쥐에서 Dot1l 의 손실 발달 단계 E10.5,2829주위 태아 죽음에 이르게. 심장 개발 및 myocardiocyte 차별화, DOT1L 유전자 표현 규칙30에 대 한 필수적입니다. 중앙 신 경계에 DOT1L 기능 신경 튜브 개발31에 연루 수 있습니다, 그것은 Tbr1억제에 관여-개 개발32, 중 식 그리고 ER 스트레스의 규정에서 작동 수 있습니다 응답 유전자33. 부분적으로 이해 하는32만 맞는 활성화 또는 억압 작업과 H3K79me의 특히 중앙 신경 시스템의 개발 같은 경우 vivo에서 날짜입니다. H3K79 메 틸 화는 히스톤 3의 구형 도메인에 위치 하 고 있습니다, 이후 그것은 sterically 유연한 히스톤 꼬리23에 수정에 비해 액세스. H3K79 메 틸 화의 기능을 이해 하려면 그것의 위치 및 게놈 환경 결정을 신뢰성과 재현성 분석 방법 필요 합니다. 이 방법 종이에서는 다른 신경 창시자 (피 질에 대 한 Cpc) 및 소 뇌에 대 한 CGNPs, 효과적인 DOT1L 억제제 치료, 및 칩 메서드 분석 정량 또는 다른 시간에 시퀀싱을 통해 메 틸 H3K79를의 격리 방법 소개 대뇌와 소 뇌 개발 하는 동안 포인트입니다. 에 대 한 프로토콜 및 그것의 가능성의, 그림 1을 참조 하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
히스톤 수정, 녹음 방송 요인, 히스톤 코드 독자, 작가, 또는 지우개의 게놈 인 검출 하기 chromatin immunoprecipitation를 수행 하기 위해 두 가지 주요 방법이 있다. 하나는 nuclease 소화, immunoprecipitation에 대 한 네이티브 chromatin를 사용 하 여 네이티브 칩 방법 이며 다른 PFA 고정, 전단 chromatin, 있는 nucleosomes와 다른 DNA 연결 단백질 covalently에 바인딩된 DNA를 사용 하 여 제시 방법 39. 네이티?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 Henriette Bertemes 실험실 내 CGN 재배 프로토콜을 설정 하는 데 도움. 이 방법은 종이 DFG 투자 CRC992 의료 Epigenetics tv 자금으로 지원 했다. 저자 인정 프라이부르크 갤럭시 팀의 지원: Pavankumar Videm, 비 Grüning와 교수 Rolf Backofen, 생물 정보학, Freiburg의 대학, 독일 공동 연구 센터 992 의료 Epigenetics (DFG 부여 SFB 992/1 2012)에 의해 투자 독일 연방 교육부의 교육 및 연구 (BMBF 그랜트 031 A538A 로얄 (드. NBI))입니다.
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
Referenzen
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