Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente
Summary
Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.
Abstract
Die Netzhaut ist ein komplexes Gewebe, die initiiert und die ersten Schritte der Vision integriert. Funktionsstörung des retinalen Zellen ist ein Markenzeichen von vielen blendenden Krankheiten, und zukünftige Therapien abhängen, wie verschiedene Retinal grundlegende Verständnis, dass Zellen normal zu funktionieren. Gewinnung solcher Informationen mit biochemischen Methoden hat schwierig erwiesen, da Beiträge von bestimmten Zelltypen in der Netzhaut Zellmilieu vermindert werden. Live retinale Bildgebung bieten einen Überblick über zahlreiche biologische Prozesse auf subzellulärer Ebene, dank einer wachsenden Zahl von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren. Jedoch wurde diese Technik bisher beschränkt, Kaulquappen und zebrafischlarven, die äußersten Netzhaut Schichten der isolierten Netzhaut oder niedriger Auflösung Bildgebung der Netzhaut mit lebenden Tieren. Hier präsentieren wir eine Methode zur Erzeugung von live ex Vivo retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für live Imaging über konfokalen Mikroskopie. Dieses Präparat liefert Quere Scheiben mit allen Schichten der Netzhaut und die meisten Zelltypen sichtbar für die Durchführung von konfokalen bildgebender Untersuchungen mit Perfusion. Transgene Zebrafisch mit dem Ausdruck ihrer fluoreszierende Proteine oder Biosensoren in bestimmten retinalen Zelltypen oder Organellen sind einzellige Informationsextraktion aus eine intakte Netzhaut verwendet. Darüber hinaus können retinale Scheiben mit fluoreszierenden indikatorfarbstoffen, die Methode Vielseitigkeit hinzu geladen werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt für imaging Ca2 + im Zebrafisch-Zapfen-Photorezeptoren, aber mit richtigen Marker könnte es um Ca2 + oder Metaboliten in Müller-Zellen, bipolar und horizontalen Zellen, Mikroglia, amakrinen Zellen oder Retinal Messen angepasst werden Ganglienzellen. Das retinale Pigmentepithel wird aus Scheiben entfernt, so ist diese Methode nicht geeignet für das Studium dieser Zelltyp. Mit etwas Übung ist es möglich, seriellen Scheiben von einem Tier für mehrere Experimente zu generieren. Diese anpassungsfähige Technik ist ein leistungsstarkes Tool für die Beantwortung vieler Fragen über retinale Zellbiologie, Ca2 +und Energie-Homöostase.
Introduction
Der Zebrabärbling (Danio Rerio) hat in medizinischen und grundlegende wissenschaftliche Forschung1, aufgrund seiner geringen Größe, schnelle Entwicklung und vertebrate Organsysteme verbreitet werden. Die natürliche Transparenz des zebrafischlarven in Kombination mit bewährten Methoden für die Transgenese konnten detaillierte Visualisierung zellulärer Prozesse in ein lebendes Tier. Eine Reihe von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren haben spezifische Zebrafisch Zellen zur Erkennung von Ca2 + 2, Wasserstoffperoxid3, apoptotischen Aktivierung4 und ATP5ins Visier genommen.
In-Vivo Bildgebung von zebrafischlarven führte zum Durchbruch auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, einschließlich der Zuordnung von Gehirn Schaltungen6 und Arzneimittelentwicklung für zentrale Nervensystem Erkrankungen7. Zebrafisch eignen sich gut für Vision Forschung, weil ihre Netzhaut sind mit laminarer Struktur und Neuron Typen der höheren Wirbeltiere, und sie zeigen robuste visuelle Verhalten8,9. Verschiedene Arten von retinalen Degenerationen analog zur menschlichen Krankheit wurden erfolgreich modelliert und im Zebrafisch10,11, einschließlich live Darstellung der einzelnen Fotorezeptoren degeneriert innerhalb einer Netzhaut-2untersucht, 12.
Während in Vivo Larven Zebrafisch-Bildgebung ein wertvolles Instrument ist, wird es schwieriger, wenn Fische wachsen und sich entwickeln Pigmentierung, und einige pharmakologischen Behandlungen können kein ganzes Tier zu durchdringen. Darüber hinaus ändern bestimmte zelluläre Prozesse mit Entwicklung und Alter, machen spätere Zeitpunkte für Verständnis-Funktion und das Fortschreiten der Krankheit bei erwachsenen Tieren. Biochemische Methoden wie Immunoblot, Quantitiative PCR, O2 Verbrauch und Metabolomic Analysen liefern wichtige Hinweise zur Biologie der Netzhaut als Ganzes, aber es ist schwer zu erkennen, Beiträge der einzelnen Zelltypen betroffen Erkrankung. Isolierte netzhautgewebe ex Vivo Imaging umgeht diese Probleme, und während imaging-flach montierten Netzhaut bietet einen Ausblick auf die äußere Netzhaut13, tiefere inneren Netzhaut Eigenschaften verdunkelt. Transversale Retinal Scheiben, wie die in festen immunhistochemische Analysen einen klaren Überblick über alle Schichten und Zelltypen ermöglichen bieten aber nur eine Momentaufnahme der dynamischen Prozesse in der normalen Funktion und Krankheit.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von ex-Vivo quer retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für die Bildgebung. Es ähnelt dem Verfahren zur Herstellung von Amphibien und Zebrafisch retinaler Scheiben für elektrophysiologische und morphologische Studien14,15, mit wichtigen Änderungen für Zeitraffer- ex Vivo mit confocal imaging Mikroskopie. Fluoreszenz Antworten von Biosensoren oder Farbstoffen in Scheiben werden in Echtzeit mit einem konfokalen Mikroskop überwacht, während liefern pharmakologische Wirkstoffe mit Perfusion. Während die Methode für die Photorezeptoren imaging entwickelt wurde, kann es, es zu benutzen, zur Visualisierung von Müller-Zellen, Bipolarzellen, horizontalen Zellen, amakrinen Zellen oder retinalen Ganglienzellen mit entsprechenden fluoreszierende Markierungen möglich sein. Darüber hinaus können die Scheiben mit Zelle durchlässig Fluoreszenzfarbstoffen Bericht Zellviabilität, vesikuläre Transport, mitochondriale Funktion oder Redox-Zustand geladen werden. Diese vielseitige Vorbereitung ermöglicht Visualisierung einer breiten Palette von subzellulären Prozessen in der Netzhaut, einschließlich Ca2 + Dynamik, Signaltransduktion und metabolischen Zustand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex-Vivo Bildgebung frische Zebrafisch retinalen Scheiben erweist sich ein vielseitiges Werkzeug für das Studium Photorezeptor Biologie20,21,22und ist einzigartig, da es ermöglicht Analyse einzelner Zellen in eine Reife, voll differenzierte Netzhaut. Mit etwas Übung ist es möglich, mehrere Experimente mit Gewebe von Fischen, auch mit seriellen Scheiben aus dem gleichen Teil der Netzhaut. Zusätzlich zu den Herausford…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ralph Nelson und Daniel Possin für durchdachte Beratung bei der Entwicklung dieses Protokoll, und Eva Ma Ashley und George Gail Stanton zur Erzeugung von stabilen transgenen Zebrafisch-Linien. Die Arbeit wurde unterstützt durch NSF GRFP 2013158531, M.G., NIH NEI 5T32EY007031, W.C. und M.G. und EY026020, j.h. und S.B.
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
Referenzen
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